绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。

重组HSV1-tkGFP/GCV荧光蛋白示踪系统的构建及对小鼠黑色素瘤的抑制作用

目的建立具有绿色荧光蛋白(GFP)示踪功能的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因/更昔洛韦自杀基因系统(HSV1-tkGFP/GCV),并检测该系统对小鼠黑色素瘤的抑制作用。方法将阳性重组质粒pLXSN-tkGFP和pLXSN-DsRed2分别转染B16细胞,加G418进行筛选。用GCV(5,50,500μmol·L-1)杀伤实验验证tk基因的表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)法和荧光示踪法验证该系统存在旁杀伤效应。将B16-tkGFP和B16-RFP细胞按1∶1混合,接种于C57BL/6J小鼠进行肿瘤模型复制,随机分为模型组和GCV(50 mg·kg-1·d-1)组,腹腔注射给药,每3 d检测1次肿瘤大小(n=14)。结果成功获得能发出绿色荧光的B16-tkGFP细胞和能发出红色荧光的B16-RFP细胞,且tk基因在B16-tkGFP细胞中表达正常。该系统存在一定的旁杀伤效应。与模型组比较,GCV组小鼠肿瘤生长受到明显抑制(P<0.01)。结论重组HSV1-tkGFP/GCV系统对小鼠黑色素瘤有明显抑制作用,并可实现直观检测其旁杀伤效应,为后续中药联合自杀基因疗法的研究奠定基础。

立体定向精准放射治疗对老年非小细胞肺癌的临床疗效及对外周血CTCs和TK1的影响

目的:探讨立体定向精准放射治疗(SBRT)对老年非小细胞肺癌(NSCLC)的临床疗效及对外周血循环肿瘤细胞(CTCs)和胸苷激酶1(TK1)的影响。方法:选取医院收治的60例NSCLC患者,依据随机数表法将其分为观察组和对照组,每组30例。观察组采用SBRT,对照组采用常规放射治疗,记录治疗期间两组不良反应发生情况,随访3年记录生存期。评估治疗前后肺功能,以及治疗前后、治疗后1年和末次随访检测外周血CTCs数目和TK1水平。结果:观察组治疗总有效率和疾病控制率分别为63.3%和86.7%,显著高于对照组的36.7%和63.3%,差异有统计学意义(x^(2)=4.267,x^(2)=4.356;P<0.05)。治疗后,观察组肺通气阻抗中的中心阻力(Rc)、周边阻力(Rp)、5 Hz的总气道阻力(R5)、20 Hz的总气道阻力(R20)和呼吸总阻抗(Zrs)指标均低于对照组,差异有统计学意义(t=4.076,t=3.429,t=3.942,t=3.083,t=3.545;P<0.05);观察组不良反应中恶心呕吐、食欲下降、皮肤瘙痒和湿疹均低于对照组,差异有统计学意义(x^(2)=4.800,x^(2)=4.444,x^(2)=4.022,x^(2)=4.356;P<0.05);观察组放射性肺炎、放射性食管炎发生率低于对照组,差异有统计学意义(x^(2)=19.631,x^(2)=10.814;P<0.05);观察组各时间点外周血CTCs数目、TK1水平均低于对照组,差异有统计学意义(F=19.834,F=15.023;P<0.05)。观察组中位生存期显著高于对照组,差异有统计学意义(x^(2)=21.280,P<0.05)。结论:SBRT对老年NSCLC安全性高,对肺损伤小,不良反应少,并能降低外周血CTCs数目和TK1水平,改善肺功能,提高近期疗效,延长生存期。

血清胸苷激酶（TK1）对健康体检人员中进展期癌前病变风险进程的跟踪研究

目的：探讨血清胸苷激酶（TK1）水平在健康体检人员中不同性别、不同年龄中的差异，以及在健康体检人员中血清胸苷激酶（TK1）的阳性率及在肿瘤早期筛查中的作用和对于进展期癌前病变恶性风险进程的跟踪研究。方法：选取1200例健康体检人员根据性别和年龄分为男性年龄（20-39岁）组、男性年龄（40-80）组；女性年龄（20-39岁）组、女性年龄（40-80）组；；应用免疫印迹-增强化学发光法检测血清胸苷激酶（TK1）水平，采用χ2及Fisher确切概率法分析。结果：TK1检测灵敏度为0.2 pmol/L-（2）男性634例，平均年龄48.5岁（22-80岁）,TK1水平为0.15-54.90（1.164士2.092） pmol/L，阳性（〉=2.0）30例，阳性率4.47%；女性586例，平均年龄46.0岁（21-77岁）,TK1水平为0.11-14.53（1.198±1.053）pmol/L,阳性（〉=2.0）46例，阳性率7.81%；男女性别比较P =0.069，无显著差异；（3）男性年龄（20-39岁）组TK1水平（1.023±0.661） pmol/L.男性年龄（40-80）组TKl水平（（1.194±2.609） pmol/L,两组比较P=0.11，无显著差异；女性年龄（20-39岁）组TKI水平（1.19±0.825） pmol/L，女性年龄（40-80） TK1水平（1.21±1.125） pmol/ L，两组比较P=0.27.无显著差异。结论：（1） TKI水平在健康体检人员中含量差别甚远，但不同性别、不同年龄中的差异经统计学处理均无显著差异（2）TK1水平在健康体检人员中阳性率较高，表明影响TK 1的因素较多必需排除一些生理状态等因素引起的TKI水平升高（3）血清TK1表达具有很高的增殖特异性和灵敏度，因此，在肿瘤早期筛查中有重要的应用价值。

细胞质胸苷激酶在肺癌诊断中的应用价值探讨

目的探讨细胞质胸苷激酶(TK1)在肺癌临床诊断中的价值。方法选取2016年1~6月收住本院的肺癌患者50例,其中腺癌23例、鳞癌27例,门诊良性肺疾病患者50例以门诊健康体检者50例作为对照组,分别检测血清中TK1、Cy211、NSE、CEA水平及肺癌患者治疗前后血清相关标志物的水平。结果肺癌患者血清TK1、Cy211、NSE、CEA检测水平明显高于良性肺部疾病组和对照组,其敏感度分别为66%、58%、30%、23%,特异度分别为82%、86%、93%、89%。但是不同病理分型的肺癌患者血清相关标志物的表达无差异。肺癌患者治疗前血清肿瘤相关标志物的水平明显高于治疗后。结论 TK1对肺癌诊断的敏感度较Cy211、NSE、CEA高,可作为一种新的肿瘤标志物应用在肺癌早期筛查及疗效检测。

重组腺病毒介导自杀基因HSV1-tk转染内皮祖细胞的实验研究

[目的]构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸腺激酶基因(HSV1-tk)的重组腺病毒载体,并感染大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs),以期用于抗肿瘤血管生成的基因治疗及核素报告基因显像。[方法]从大鼠骨髓中分离、培养EPCs,利用流式细胞术进行鉴定。构建重组腺病毒载体Ad5-HSV1-tk-EGFP,并感染EPCs,以腺病毒Ad5-EGFP为对照。利用RT-PCR法、Westernblot免疫印迹法检测HSV1-tk的表达,利用MTT法检测更昔洛韦(GCV)对病毒感染后EPCs的杀伤作用。[结果]流式细胞术结果显示从大鼠骨髓中分离出的EPCs阳性表达CD34(80.09%)和CD133(81.75%),RT-PCR及Westernblot免疫印迹结果显示HSV1-tk基因在转录及蛋白水平可以正确表达,MTT结果显示HSV-tk/GCV自杀基因系统对EPCs细胞具有明显的杀伤作用。[结论]重组腺病毒Ad5-HSV1-tk-EGFP感染EPCs后可以在细胞中成功表达,并且感染后自杀基因具有生物学活性,从而为利用EPCs作为载体进行肿瘤靶向基因治疗、报告基因显像提供实验依据。

HIFU联合包裹单纯疱疹病毒-胸苷激酶的超声微泡治疗对兔VX2肝移植瘤血管生成的影响

目的观察高强度聚焦超声(High-intensity focused ultrasound,HIFU)联合包裹单纯疱疹病毒-胸苷激酶(Herpessimplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)的超声微泡(Ultrasound microbubble)治疗对兔VX2肝移植瘤中缺氧诱导因子-1α(Hy-poxia inducible factor-1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达及微血管密度(Mi-crovascular density,MVD)的影响,并探讨其机制。方法复制兔VX2肝移植瘤模型,建模4周后,将荷瘤兔随机分为4组:对照组(A组),HIFU组(B组),超声辐照载基因微泡组(C组)和HIFU联合超声辐照载基因微泡组(D组)。治疗后两周观察肿瘤大小,免疫组化法检测肿瘤组织中HIF-1α和VEGF蛋白的表达及MVD,Real-time PCR检测肿瘤组织中HIF-1α和VEGF基因mRNA的转录水平。结果治疗后2周,B、C、D组肿瘤组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达量,基因mRNA转录水平,MVD及肿瘤体积均明显低于A组(P<0.05),且D组明显低于B组和C组(P<0.05)。结论 HIFU联合包裹HSV-TK基因的超声微泡治疗可抑制肿瘤生长及肿瘤血管新生,降低残余瘤区HIF-1α和VEGF基因的表达,提高HIFU的疗效。