桑树Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达

【目的】研究川桑液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)基因的功能,探究桑树耐盐机制,为植物抗逆基因工程筛选提供优良的候选基因。【方法】以川桑基因组数据库为基础,基于同源基因序列的保守性,以川桑叶片cDNA为模板克隆川桑液泡膜型NHX基因;利用生物学软件和在线公共平台,分析所得基因编码的蛋白质序列及功能结构域,并构建系统进化树,分析与其他物种的亲缘关系。采用荧光定量PCR方法研究在NaCl胁迫条件下不同时间段‘湖桑32号’根、茎、叶等不同组织中桑树NHX1表达量的变化情况;通过构建超量表达载体,将其转化到拟南芥中,分析转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中的种子发芽数,根长、侧根生长情况和幼苗成活率,并对转基因拟南芥连续浇灌含高浓度Na Cl的营养液,研究过量表达NHX基因对拟南芥的影响。【结果】本研究得到1个液泡膜型NHX基因,命名为MnNHX1(Gen Bank登录号:KJ720637);该基因ORF长度为1 644bp,编码547个氨基酸残基,具有Na+/H+交换泵,且在其上游含有抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点(LFFIYLLPPI)以及糖基化位点等结构域,TMHMM在线程序预测Mn NHX1具有12个明显的跨膜结构区;系统进化树分析结果显示,Mn NHX1具有较高的保守性,先与源于蔷薇科的桃聚合,与桑树形态学和基因组进化分析分类结果一致。荧光定量PCR试验表明,在无Na Cl胁迫条件下桑树NHX1在‘湖桑32号’根、茎、叶中均有表达;在Na Cl胁迫处理12 h后,根、茎中桑树NHX1的表达量显著增加,而后回落;而在胁迫处理24 h后,叶中桑树NHX1的表达量显著提高,随后回落。过量表达Mn NHX1的转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中,种子发芽率低于野生型,而根长和侧根生长情况以及幼苗成活率都优于野生型;连续浇灌含高浓度Na Cl营养液的转基因拟南芥生长状态更为优良。【结论】MnNHX1为优良的植物耐盐基因,在桑树中为组成型表达,并受Na Cl胁迫诱导,表现出组织特异性。过量表达Mn NHX1的拟南芥耐盐能力显著提高,生存在盐胁迫环境中,依然具有良好的生长和发育能力。

大叶补血草Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及序列分析

根据同源序列区域设计简并引物,利用RT-PCR及RACE方法从盐生植物大叶补血草中分离了Na+/H+逆向运输蛋白基因的cDNA(LgNHX1,GenBank登录号EU780457)。LgNHX1的cDNA全长为2 397 bp,5′端非翻译区长度为512 bp,3′端非翻译区长度为229 bp,其中包括12 bp的poly(A)尾巴,中间的开放读码框为1 656bp,编码1个550个氨基酸的多肽,推测分子量为61 kD。氨基酸同源性分析表明,LgNHX1与北滨藜、小麦、盐角草和拟南芥液泡Na+/H+逆向运输蛋白的一致性分别为82.62%,82.01%,80.64%和75.86%。预测分析表明,LgNHX1具有11~12个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白(LgNHX1)与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型的Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。

番杏Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析

根据同源序列设计筒并引物，通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物番杏中克隆出Na^+／H^+逆向运输蛋白基因。序列分析表明，该cDNA全长2199bp，开放读码框为1665bp，可编码一个554个氨基酸的多肽，与其他植物中已经克隆的Na^+／H^+逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(TtNHX1)与液泡型的Na^+／H^+逆向转运蛋白的亲缘较近，与质膜型的Na^+／H^+逆向转运蛋白亲缘关系较远。TtNHX1的表达具有组织特异性，在番杏的根、茎和叶中均有表达，而花中没有表达。经NaCl诱导后根、茎和叶中的表达量增加，而花中仍没有表达。

紫花苜蓿Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料,利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明,在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明,该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na+/H+逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明,MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性,说明MsNHX1具有转运Na+的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力;而且在受到盐胁迫时,转基因植株比野生型的渗透调节能力更强,生物膜受破坏程度降低,光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白,在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。

菊芋Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

根据同源序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法从菊芋中克隆了Na+/H+逆向转运蛋白基因。序列分析表明,该基因全长2148 bp,开放读码框为1647 bp,可编码长549个氨基酸的多肽,与其它植物已克隆的Na+/H+逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(HtNHX1)与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。NaCl胁迫条件下RT-PCR检测结果表明,HtNHX1随NaCl浓度增加和处理时间延长表达持续增强,但到了第3天表达量开始下降。HtNHX1逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定菊芋耐盐能力的一个重要因素。

转Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(nhaA)大豆植株的获得及耐盐性分析

高盐对作物造成渗透胁迫和离子毒害,是影响作物生长发育的主要非生物胁迫因子之一。Na+/H+逆向转运蛋白能够通过将Na+排出细胞或将其区隔化入液泡中来调节细胞内的离子平衡,是植物耐盐的关键因子。本研究将质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA构建到植物表达载体pBI121上,通过发根农杆菌介导转化大豆子叶节,获得6株卡那霉素抗性再生植株。对抗性植株进行PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定,3株植株呈阳性,平均转化率为0.42%。对阳性植株的耐盐生理指标测定结果显示,盐胁迫后转基因植株的质膜相对电导率显著低于对照植株,叶绿素含量和脯氨酸含量显著高于对照植株。nhaA基因在大豆植株中的表达显著提高了大豆对盐胁迫的耐受性,为大豆耐盐新品种的选育和广泛应用该基因进行其它农作物的耐盐性改良提供了材料和依据。

泌盐植物长叶红砂质膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因(RtSOS1)全长cDNA的克隆及序列分析

长叶红砂为内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有珍稀泌盐,强旱生小灌木,对盐渍荒漠环境具有极强适应性。利用RT-PCR和RACE技术从该植物中分离出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(RtSOS1),该cDNA全长为3 829bp,开放阅读框为3 438 bp,编码一个含1 145个氨基酸的蛋白质,推测分子量为126.76 kDa。氨基酸序列的生物信息学分析推测,该蛋白N端含有11个跨膜结构域,C端为一个长约700个氨基酸的亲水性尾,具有磷酸化和自我抑制结构域。同源性比对和系统发育分析证实,RtSOS1与其他植物的质膜Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较近。

一个新的水稻液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特征

通过RT-PCR技术从水稻幼苗组织中克隆了一个新的Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2,它编码一条长544氨基酸的多肽。OsNHX2与水稻和拟南芥的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白OsNHX1、AtNHX1氨基酸序列一致性分别为78%和77%。基因结构分析表明OsNHX2与OsNHX1具有类似的外显子和内含子构成,但不同于拟南芥AtNHX1,表明OsNHX2与OsNHX1可能起源于单双子叶植物分化后的水稻染色体复制。半定量RT-PCR方法检测了OsNHX2与OsNHX1在水稻耐盐品种韭菜青与盐敏感品种IR28的地上部与根部的表达。结果表明:耐盐品种韭菜青的OsNHX2与OsNHX1基因在盐胁迫下表达持续增强,而在盐敏感品种IR28的地上部,OsNHX2基因在盐胁迫处理后1h表达增强后立即减弱,根部的表达则基本不变,而IR28地上部与根部OsNHX1则在盐胁迫处理初期表达增强,随后即减弱。研究结果表明水稻两个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2、OsNHX1在盐敏感程度不同的水稻品种中表达有所不同,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定水稻耐盐能力的一个重要因素。

唐古特白刺质膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

土壤中过多的Na+会导致植物产生盐害,严重影响植物的生长和发育。质膜型Na+/H+逆向转运蛋白SOS1介导植物细胞内过量的Na+外排,在植物抵御盐胁迫过程中起着重要的作用。唐古特白刺隶属于蒺藜科白刺属,是中国特有的盐生植物,主要生长于西北地区的荒漠或盐渍化荒漠,具有极强的抗逆能力。应用简并RT-PCR及RACE技术克隆获得唐古特白刺Na+/H+逆向转运蛋白NtSOS1基因(GenBank登录号KC292267)。序列分析显示,该cDNA全长4 008bp,包含3 492bp的开放阅读框,编码分子量为127.59kDa的蛋白质。疏水性分析预测NtSOS1基因编码蛋白N端具有11个跨膜结构域,C端具有一个面向胞质的长亲水尾部,包含保守环核苷酸结合区域、自我抑制基序及磷酸化位点等多个活性调控结构域。NtSOS1氨基酸序列与葡萄、霸王、拟南芥等植物的SOS1序列同源性较高,分别可达71.77%,68.94%,62.65%。系统发育分析表明NtSOS1基因为质膜型Na+/H+逆向转运蛋白,与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白属于不同分支。半定量RT-PCR结果显示冷、热、盐和干旱胁迫都可以诱导NtSOS1基因的表达,同时,NtSOS1基因随着盐处理浓度增加呈现出先上升(0～300 mmol/L)后下降(400mmol/L)的趋势。结合植物的生境特点和NtSOS1表达模式分析,该基因表达水平的升高可能在唐古特白刺适应恶劣生境的过程中发挥积极作用。本研究的开展为利用NtSOS1基因进行作物与牧草改良并深入研究唐古特白刺抗逆分子机制奠定了基础。

桑树Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及功能分析

盐害是威胁作物生长的重要因素之一,培育和种植耐盐作物品系是进行盐地开发利用的有效途径。该研究通过RACE方法,从特优1#桑品种克隆获得了Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(MaNHX)的全长cDNA(2 016 bp),编码蛋白预测分子量59.28 ku,等电点6.67,含保守位点(^(82)LFFIYLLPPI^(91))。用根癌农杆菌介导法,将MaNHX基因导入拟南芥中,结果表明,在拟南芥中异源表达MaNHX能明显提高拟南芥对盐胁迫的耐受性。转基因植株NaCl胁迫下叶绿素含量更高、抗氧化活性增强,MDA含量下降。结果证实,异源表达MaNHX转基因拟南芥可以通过维持细胞膜稳定性、减少膜损伤和透性伤害等机制应对盐胁迫。该研究可为桑树的抗盐品种培育提供候选参考基因。

小拟南芥Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆新疆特色植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)的Na+/H+逆向转运蛋白基因,本研究以经200mmol/L NaCl胁迫诱导12h的叶片总cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为ApNHX1(GenBank登录号:JF357965)。结果表明:ApNHX1全长开放阅读框1617bp,编码538个氨基酸残基。利用相关的生物信息学软件对ApNHX1蛋白氨基酸的等电点、结构域、二级结构组成、跨膜结构、亲水性等进行研究,并且构建植物NHX1基因家族系统进化树,结构表明ApNHX1和拟南芥、鼠尔芥、盐芥和油菜等的NHX1同源基因遗传距离最为接近,属于Ⅰ型液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白。因此,构建植物过量表达载体p35S::ApNHX1,转化到农杆菌GV3101中,这为进一步研究基因功能奠定基础。

新疆无苞芥Na＋/H＋逆向转运蛋白基因OpNHX1的克隆、表达分析与功能验证

从耐盐植物无苞芥中克隆获得了1个Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,命名为OpNHX1(GenBank登录号:KC200248)。OpNHX1基因cDNA全长2 153 bp,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNHX1编码产物与拟南芥、小盐芥亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在无苞芥根、茎、叶、花和荚果中均有表达,其中茎中表达量最高。半定量RT-PCR分析表明,该基因受高盐、干旱、低温及ABA的诱导上调表达。进一步将该基因在拟南芥中过量表达,显著提高了转基因植株在盐胁迫下的存活率,说明OpNHX1基因参与了植物的耐盐性。酵母功能互补试验结果显示,该基因转化酵母Δnhx1后可以补充NHX1的缺失,表明OpNHX1参与Na+/H+的转运。

黄瓜质膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。

刚毛柽柳Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

通过对刚毛柽柳(Tamarix hispida)转录组分析,鉴定获得一个Na^+/H^+逆向转运蛋白基因,命名为Th SOS1。Th SOS1基因c DNA全长3 917 bp,开放阅读框长3 498 bp,编码1 165个氨基酸,编码蛋白相对分子质量128.8 k Da,理论等电点(PI)为6.42。疏水性分析预测Th SOS1基因编码蛋白N端具有10个跨膜结构域,C端具有一个较长的亲水尾部。Th SOS1氨基酸序列与长叶红砂、藜麦、盐地碱蓬等植物的SOS1序列同源性较高,分别可达92%,73%,72%。系统发育分析表明Th SOS1为质膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白,与液泡膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白属于不同分支。实时荧光定量RT-PCR分析显示,该基因受高盐、干旱诱导上调表达,暗示Th SOS1可能在刚毛柽柳抗旱耐盐过程中发挥重要作用。

假单胞菌Na^+/H^+逆向转运蛋白基因nhaA的克隆与鉴定

根据3种生物的Na+/H+逆向转运蛋白基因(nhaA)的两端序列设计引物,利用PCR从假单胞菌 (Pseudomonassp.cn4902)中克隆得到一结构基因。该基因长1089bp,编码362个氨基酸,与E.coliK12的 nhaA基因的同源性高达97.0%。将该结构基因与pBV220构建成重组载体pBVA。SDS PAGE电泳表明:含 pBVA的转化子产生较高浓度的分子量约为41kD的蛋白,与预期相符。在含NaCl1.0mol/L的培养基中生长达 到平衡期时,转化子的菌浓度约是对照的2.3倍。经原子吸收光谱测定,转化子细胞质中Na+浓度仅为对照菌的 60.4%。SDS PAGE电泳表明该基因的表达蛋白位于细胞膜(壁)上。提纯外源基因表达蛋白并对其N端8个氨 基酸进行测序,与nhaA基因推测的氨基酸序列完全相符。这些实验证实,克隆得到的基因是假单胞菌的nhaA基 因。该基因已经在GenBank登记,收录号为AY643494。

液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因沉默对霸王叶气孔特征的影响

以霸王(Zygophyllum xanthoxylum)野生型植株(WT)、液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(Zx NHX)的RNA干扰(Zx NHX-RNAi)株系L2和L7为材料,分析了Zx NHX沉默后霸王叶下表皮气孔特征的变化情况。结果表明,50 mmol·L-1Na Cl处理下,Zx NHX-RNAi株系叶下表皮气孔开度达到峰值的时间比WT延迟了4 h;渗透胁迫下,L7气孔开度的峰值比WT显著下降12%。对照条件下,L7气孔大小显著低于WT,达到峰值的时间比WT延迟6h。无论是对照条件还是盐处理或渗透胁迫下,Zx NHX-RNAi株系叶组织含水量均显著低于WT,尤其是盐处理下,L7比WT低40%。可见,Zx NHX通过调控霸王叶的水分状况,进而影响气孔运动。

刺槐Na^+/H^+逆向转运蛋白RpNHX1基因的分离和生物信息学分析(英文)

盐分胁迫严重影响植物生长和产量。为了研究木本植物对盐分的适应性,利用5'RACE技术,从刺槐中克隆得到液泡Na^+/H^+逆向转运蛋白基因RpNHX1。该基因长度为2281 bp,含有一个开放阅读框,编码535氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列与大豆GmNHX1和拟南芥AtNHX1相似,氨基酸的同源性分别达85%和69%,RpNHX1属于NHX亚族的NHX-I分枝。用生物信息学的方法预测RpNHX1具有所有Na^+/H^+逆向转运蛋白共同的结构特点,即含有疏水的N末端,10个跨膜螺旋区域和一个具有调节功能的C端亲水区域,其中氨氯吡嗪咪敏感基序和CaM结合域也是保守的。在4和5的螺旋区域之间,存在有一串带负电荷氨基酸,显示出有规律的排列模式,这些模式在生物界中的Na^+/H^+转运蛋白中是保守的。结合亲疏水资料,我们认为Na^+/H^+转运通道结构可能存在于这一区域。另外,也分析了RpNHX1可能的糖基化、酰基化和磷酸化位点。从这些数据中可以看出,RpNHX1可能在细胞中起到Na^+区隔化作用。

Na^+/H^+逆向转运蛋白基因在甜瓜不同品种中的表达

Na+/H+逆向运输蛋白基因在植物耐盐性方面起着极为重要的作用。根据同源基因保守序列设计引物,通过RACE方法从甜瓜中克隆了Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为CmNHX1(FJ843078)。序列分析表明,该基因全长2 534bp,开放读码框为1 659bp,编码553个氨基酸多肽。氨基酸同源性分析表明该蛋白与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较远。RT-PCR表达分析结果表明,CmNHX1在甜瓜根茎叶中均有表达,而且随着NaCl浓度和处理时间的增加,在根中表达持续增强,叶片中表达持续下降。耐盐品种‘金辉’根、茎和叶中的CmNHX1表达均高于盐敏感品种‘天仙’根、茎和叶中的表达。有趣的是在根中的表达,CmNHX1相对表达量在‘金辉’中是‘天仙’的2倍。CmNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性,说明CmNHX1具有转运Na+的功能。研究结果表明CmNHX1是一个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白,在甜瓜盐胁迫过程中起着重要作用。

转Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)大豆纯合系筛选及生理分析

为了获得转Na+/H+逆向转运蛋白基因(Al NHX1)大豆纯合株系并验证其盐胁迫条件下生理反应,对转Al NHX1基因T3代材料进行了PCR筛选和RT-PCR鉴定,并在水培条件下研究了纯合系植株耐盐性、K+/Na+比值、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量和相关抗氧化酶活性变化。结果显示经PCR和RT-PCR鉴定,野生型植株没有出现目的条带,而转基因株系有相应的目的条带,表明Al NHX1基因已经整合到大豆基因组中并正常转录。在盐胁迫条件下,转基因各株系成活率明显高于野生型对照,地上部干重和根部干重较野生型显著增加,达到了显著差异水平(P<0.05)。此外,在盐胁迫条件下,转基因幼苗能维持根和叶中较高的K+/Na+比值,同时伴随着植株体内MDA和H2O2含量的下降以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化酶(POD)的增加。本研究结果表明供试外源Al NHX1基因在大豆高代材料中超表达,提高了转基因大豆耐盐能力,可为进一步培育适应盐渍化土壤环境下生长的大豆新品种提供重要的种质资源。

NaCl胁迫对胡麻种子萌发、幼苗生长及Na^+/H^+逆向转运蛋白基因表达的影响

为研究胡麻种子萌发和幼苗生长期对不同浓度NaCl胁迫的响应情况,以胡麻品种定亚17号为材料,研究了0、50、100、150、200mmol/L NaCl胁迫下胡麻种子萌发及幼苗生长情况。结果表明:随着NaCl浓度的增加,胡麻种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数均呈现逐渐下降的趋势,而幼苗的株高、根长、地上部和根部的鲜重和干重则呈现先升高后下降的趋势,在50mmol/L NaCl胁迫下高于对照,NaCl浓度高于100mmol/L时逐渐下降。NHX基因在叶片和根中均有表达,表达量均与NaCl浓度正相关,且根部受诱导程度高于叶片。