电化学发光PCR定量检测H-ras癌基因点突变

提出了一种电化学发光PCR(ECL-PCR)分析方法, 该法可用于定量检测基因点突变. 其检测H-ras癌基因PCR扩增产物的灵敏度可达100 fmol;线性范围为0.1～500 pmol. 用ECL-PCR分析法对膀胱癌组织中H-ras癌基因进行突变检测, 只需要10 μL样品, 20 min的孵育时间和30 s的采集时间, 得出20例膀胱癌样品中有7例存在点突变, 通过标准曲线方程定量计算出突变样品的量. ECL-PCR分析方法在灵敏度、线性范围、分析时间等方面都优于传统的检测方法, 是一种安全、快速、灵敏、定量检测基因点突变的分析方法.

结直肠癌虚实辨证与p21WAF1、p21H-ras蛋白表达相关性研究

目的:探讨结直肠癌虑者肿瘤组织p21WAF1、p21H-ras表达与中医虚实辨证的相关性。方法:将45例结直肠癌患者按照中医辨证标准分为虚证组,实证组,虚实夹杂证3组,应用免疫组化方法检测结直肠癌组织蛋白p21WAF1、p21H-ras表达、比较组之间的差异。结果:结直肠癌虚证组p21WAF1阳性表达承平显著低于实证及虚实夹杂证组(P=0.025),差别有统计学意义;p21H-ras阳性表达水平在虚证,实证及虚实夹杂证组三组内差异无显著性(P=0.800)。结论:p21WAF1阳性表达与结直肠癌中医病证虚实有关,p21WAF1表达低可能是结直肠癌虚证辨证分型的客观物质基础之一。

肾脏移植后慢性移植物肾病相关基因C-H-ras、TGF-β_1、HSP70和HSP90的表达

目的探讨肾脏移植后慢性移植物肾病（CAN）相关基因C-H-ras、TGF-β1、HSP70及HSP90的表达及其意义。方法实验分为3组：正常对照组10例，为正常肾脏标本；术中穿刺组10例，为肾脏移植术中复流40～60min后的移植肾穿刺标本；CAN组8例，为木后1～7年CAN患者肾组织穿刺标本。采用免疫组织化学及原位杂交法对每例标本行C—H—ras、TGF-β1、HSP70及HSP90蛋白和mRNA表达水平检测。结果术中穿刺组HSP70表达水平最高，CAN组C—H—ras、TGF-β1及HSP90表达水平最高。结论c—H—ras和TGF-β1两种基因的共同高表达与CAN的发生发展关系密切。调控相关基因的表达可能有助于延缓和治疗CAN。

H-ras干扰性RNA对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤CD44V6表达的影响

目的应用重组质粒pshRNA/H-ras转染卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠,观察Ras信号传导通路中信号分子的变化。方法选用裸鼠20只建立卵巢癌裸鼠皮下成瘤模型,分别设立对照组和实验组,应用陡脉冲电转重组质粒pshRNA/H-ras于瘤体中,于治疗后21天处死裸鼠并取瘤体组织固定,免疫组织化学SP法检测CD44V6的表达。结果对照组细胞膜、浆中见变异型细胞黏附分子44(CD44V6)的阳性表达,而转染pshRNA/H-ras实验组CD44V6的表达显著下降,差异有统计学意义(P＜0．05)。结论H-ras的小干扰性RNA可下调与肿瘤转移相关基因的表达,对阻止肿瘤侵袭转移具有较好的研究价值。

乙肝病毒X蛋白增加HepG2细胞ras表达

目的:研究转染乙肝病毒X基因后HepG2肝癌细胞H-ras表达的变化,以及拉米夫定是否能抑制其表达。方法:采用细胞免疫化学法、Westernblot技术检测乙肝病毒X蛋白对HepG2细胞以及核苷类似物拉米夫定对转染有乙肝病毒X基因的HepG2x细胞H-ras表达的影响。结果:X蛋白能增加HepG2细胞胞浆内H-ras表达,其面积光密度值较转染前明显增加(P<0.01),4.36×10-4mol/L拉米夫定能降低HepG2x细胞H-ras蛋白表达,其蛋白条带面积灰密度值明显低于对照(P<0.01),但拉米夫定不影响HepG2细胞H-ras表达(P>0.01)。结论:X蛋白上调肝癌细胞H-ras表达,提示可能促进HepG2细胞恶性转化。拉米夫定能抑制H-ras表达,提示拉米夫定可能遏制X蛋白的致癌作用。

RNA干扰H—ras基因对鼻咽癌细胞西妥昔单抗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰H-ras基因对鼻咽癌细胞西妥昔单抗敏感性的影响。方法采用逐步增加剂量法诱导建立西妥昔单抗耐药人鼻咽癌细胞系5-8WErbitux。Western blot法检测H-ras和K-ras蛋白的表达，实时荧光定量PCR检测H—ras和K—ras基因的表达量。构建靶向H-ras基因的shRNA真核表达载体，转染5-8F／Erbitux细胞，分别检测转染后5-8F／Erbitux细胞中H—rgs蛋白及基因的表达以及对西妥昔单抗敏感性的改变。结果西妥昔单抗作用3d和5d，5-8F／Erbitux细胞的耐药指数（RI）分别为1．2和1．1。5-8F／Erbitux细胞中，H-ras和K—ras蛋白表达水平分别为0．798±0．019和0．190±0．011，显著高于5—8F细胞（0．075±0．005和0．079±0．009，P〈0．001）；5-8F／Erbitux细胞中，H—ras和K—ras基因表达量分别为1．260±0．114和0．850±0．006，与5—8F细胞比较，H．ras基因表达量显著升高（P=0．016），K-ras基因表达量显著下降（P=0．000）。H—ras—shRNA转染后，5-8F／Erbitux细胞中H—ras蛋白及基因表达均下降，细胞凋亡率及西妥昔单抗细胞增殖抑制率均显著升高（P〈0．001）。结论通过下调H—ras基因的表达可以逆转5-8F／Erbitux细胞对西妥昔单抗的耐药，5-8F／Erbitux细胞耐药性的产生与H—ras基因扩增与过表达有关。

靶向性发夹状RNA对卵巢癌SKOV3细胞H-ras基因表达的影响

目的 运用构建的小发夹状RNA重组质粒pshRNA／H—ras，研究其对卵巢癌SK—OV3细胞株内源H-ras基因的抑制作用。方法 应用基因克隆技术，设计含21bp H—ras基因编码序列片段及中间以4～5个bp间隔的反向重复序列，克隆至转录载体pTZU6＋1上并行序列分析。转染重组质粒pshRNA／H—ras至SKOV3细胞中，分别采用RT-PCR、Western blot检测细胞内H-rasmRNA和蛋白表达的变化。结果 成功构建发夹状RNA载体，经DNA序列鉴定为正确的目的序列。RT-PCR和Western blot结果表明，重组质粒pshRNA／H—ras1和pshRNA／H—ras2均能在基因转录水平和蛋白表达水平上明显抑制SKOV3细胞内源H—ras蛋白的表达，抑制率达67％以上。结论 重组质粒pshRNA／H—ras可显著抑制SKOV3细胞内源H-ras基因mRNA的转录和相应蛋白质的表达，为进一步研究H-ras基因在卵巢癌细胞异常增殖中的作用打下基础。

SBHL对HeLa细胞c-myc,H-ras和hTRT基因表达的研究

目的观察澳洲茄胺盐酸盐对HeLa细胞c-myc，H—ras和hTRT基因表达的影响．方法用鼠抗人c-mycMcAb，H-ras McAb和hTRTPcAb作为一抗，生物素化羊抗鼠IgG作为二抗，用免疫组化方法测定澳洲茄胺盐酸盐对HeLa细胞c-myc，H—ms和hTRT基因的表达．结果澳洲茄胺盐酸盐处理的HeLa细胞与对照组相比，c-myc，H-ras和hTRT基因的表达均明显降低（P〈0．05）．结论澳洲茄胺盐酸盐下调HeLa细胞c-myc和H-ras基因的表达，抑制细胞增殖，诱导分化；澳洲茄胺盐酸盐下调HeLa细胞hTRT基因的表达，抑制端粒酶活性，抑制细胞生长．

胃癌组织中法尼基转移酶基因表达与临床病理特点及H-ras突变的关系

目的:检测人胃癌及相应癌旁组织中法尼基转移酶(FTase)β-亚单位mRNA表达和H-ras基因第12密码子点突变探讨FTaseβ-亚单位基因在胃癌中的表达与临床病理特点、H-ras基因突变的关系.方法:收集胃癌及相应癌旁正常组织标本43例.应用半定量逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)测定FTaseβ-亚单位mRNA基因表达水平,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析H-ras基因第12密码子点突变情况.采用秩和检验分析胃癌和癌旁组织的FTaseβ亚单位mRNA表达的配对数据的差异;采用多元逐步回归分析胃癌组织中FTaseβ亚单位mRNA表达活性与临床病理特点及H-ras基因突变间的关系.结果:胃癌组织中FTaseβ亚单位mRNA的平均值明显高于癌旁组织(0.89±0.48vs0.69±0.40),两者相比有显著性差异(Z=2.469,P=0.014).在43例胃癌组织中有1例发现突变(1/43,2.3%),癌旁组织中未发现突变.胃癌组织的FTaseβ亚单位mRNA表达活性与年龄、肿瘤部位、组织学分级、有无淋巴结转移及有无H-ras基因突变无关,在女性,病理分型为印戒细胞癌的胃癌组织中有较高的FTaseβ亚单位mRNA表达活性.结论:FTaseβ亚单位mRNA在胃癌组织中表达升高.胃癌组织中H-ras基因第12密码子点突变率低,在胃癌的发生中不起主要作用,并且与FTaseβ亚单位mRNA的表达无相关.

癌基因H-ras与抑癌基因P16在膀胱癌发生中关系的探讨

目的 :了解膀胱移行细胞癌中H -ras基因突变与P16抑癌基因缺失两者的关联 .方法 :应用PCR -SSCP银染和双重PCR对 31例膀胱移行细胞癌分别进行缺失和突变检测 .结果 :H -ras基因突变发生率为 38 7% ,P16抑癌基因缺失率为 2 2 6 % ,7例P16抑癌基因的缺失中同时存在 3例H -ras基因突变 ,两者的相关性为 4 2 9% .结论 :H -ras基因突变与P16抑癌基因缺失在膀胱移行细胞癌的发生中是否有密切相关性 。

癌基因H-ras启动子区重新甲基化抑制胃癌细胞生长的实验研究

目的:探讨癌基因启动子区域重新甲基化对胃癌细胞生长的影响。方法:用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)使胃癌细胞系MGC-803中癌基因H-ras启动子区域重新甲基化,MTT法检测肿瘤细胞生长状态;MSP法检测H-ras启动子区域甲基化状态;细胞免疫荧光染色检测H-RAS蛋白的表达。结果:胃癌细胞系MGC-803经SAM处理后癌基因H-ras启动子区域重新出现甲基化;经SAM处理的胃癌细胞组与对照组相比,细胞生长受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.05);H-RAS蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SAM能够使MGC-803中癌基因H-ras启动子区域重新甲基化,降低H-RAS蛋白的表达水平,且有效抑制了肿瘤细胞的生长,从而为肿瘤治疗提供了新的靶点。

癌基因的并合表达:乳腺癌中H—ras、C—myc、C—fos和p53的预后意义

常用判断乳腺癌预后因素有:腋淋巴结转移及受侵数目、雌激素和孕激素受体的阳性率、原发肿瘤的大小以及诊断时的肿瘤病理分期.近期在人体乳腺癌可检出多种癌基因及其产物,但有关其与疾病结局的关系仍有争论.作者应用单克隆抗体cS93.1、9E1.0、F235-1.7.1和PAb1801针对所研究的癌基因蛋白,经抗生物素蛋白-生物素复合物免疫过氧化物方法作C-fos、C-myc、H-ras和p53结合癌基因蛋白的免疫组化染色,对85例乳腺癌 (1、ⅡA和ⅡB期)的病理组织进行了分析.40例(47%)已有癌肿复发,经随访48月(6～180月),余45例仍无转移迹象,作分子生物学测定,并与临床病理情况作相关性研究,以明确单一或多种癌基因并合表达的比例及其判断癌肿复发的价值.结果 癌基因表达的种类越多,癌肿的复发率越高,如一种基因表达为17.2%,二种表达为56.3%.三、四种表达则达100%(P=0.001).无癌基因表达者,无病生存23.4月,总生存期56.4月;

L-myc和H-ras基因多态性与结直肠癌发病风险的关系

目的探讨原癌基因L-mye和H-ras的多态性以及基因一基因交互作用与结直肠癌发病风险的关系。方法应用病例对照研究，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测浙江省嘉善县373例结直肠癌患者和838例健康对照的L-mye、H-ras基因型。采用Mantel-Haenzsel分层分析、叉生分析等统计学方法分析基因-基因交互作用，并采用多因子降维（MDR）模型进行验证。结果单基因模型显示，L-myc和H-ras的单个基因多态性与结直肠癌的发病风险无关（P〉0．05）。分层分析提示，在L—mycLS＋Ss基因型携带者中，H—rasTC＋CC基因型携带者相对于TT基因型携带者患直肠癌的风险显著增加（OR=1．81，P=0．005），但不增加结肠癌、结直肠癌的发病风险（均P〉0．05）。Logistic回归分析显示，分层后H-ras基因多态性与结肠癌、直肠癌和结直肠癌发病均无关（均P〉0．05）。在携带LL基因型的人群中，以TT基因型为参照，TC＋CC基因型不增加结肠癌、直肠癌和结直肠癌的发病风险（均P〉0．05）。叉生分析结果显示，结肠癌、直肠癌和结直肠癌患者L-myc和H-ras基因的主效应均无统计学意义（均P〉0．05）。交互作用分析结果显示，结肠癌和结直肠癌患者中L-myc和H-ras基因不存在交互作用，在直肠癌中存在正相乘模型的交互作用（OR=2．74，P=0．024）。MDR模型验证结果显示，L-myc和H-ras在直肠癌中存在基因一基因交互作用，交叉验证一致率为100％（P=0．001）。结论H．ras和L-myc多态性与结肠癌、直肠癌和结直肠癌发病风险无关，H-ras和L-myc之间的基因一基因交互作用增加直肠癌的发病风险。

靶向H-ras基因的小干扰RNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨脂质体介导的靶向H-ras基因的小发夹状RNA重组质粒对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖的抑制作用。方法:实验分4组:正常对照组(仅予脂质体处理)、转染psh RNA/H-ras处理24h组、48h组及72h组。分别于转染后不同时间进行MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期检测和AO/EB双染实验,观察各组细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化。结果:FCM显示转染psh RNA/H-ras 24h及48h后的SKOV3细胞均出现细胞周期的抑制,48h后SKOV3细胞有显著的凋亡发生;转染psh RNA/H-ras1和pshRNA/H-ras2对SKOV3细胞克隆形成的抑制率分别为51.5%(P<0.05)和63.3%(P<0.01);MTT检测转染psh RNA/H-ras1和psh RNA/H-ras 272h后对SKOV3细胞增殖抑制率分别为62.5%和64.5%。AO/EB实验显示48h细胞的凋亡率为29.3%(P<0.05)。结论:重组质粒psh RNA/H-ras在人卵巢癌SKOV3细胞中有明显抑制细胞增殖的作用,并介导肿瘤细胞的凋亡。

高灵敏度电化学发光PCR方法检测基因点突变研究(英文)

近年来发展了一种用于定量检测基因点突变的电化学发光PCR方法。该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对待测基因进行PCR扩增;随后,采用特定的限制性内切酶对扩增产物进行酶切,由于野生型样品和突变型样品间存在酶切位点的变化,其中只有一种基因型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到样品池中;进行电化学发光检测,通过所得信号的有无可以判断其基因型。我们分别将该法用于Presenilin-1基因和H-ras癌基因的点突变检测,结果均可明显区分突变型样品和野生型样品。该法具有灵敏、快速、简便、安全等优点,是一种实用的基因点突变检测方法。