H因子结合蛋白作为B群流脑候选疫苗抗原的研究进展

脑膜炎奈瑟菌表面蛋白H因子结合蛋白(f HBP),是脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白和重要毒力因子,能与补体调节蛋白H因子结合。结合于脑膜炎奈瑟菌表面的H因子,能下调补体系统的激活作用,使脑膜炎奈瑟菌逃避补体系统的攻击。f HBP能诱导机体产生高水平的保护性抗体,抗f HBP抗体与f HBP结合后可阻止f HBP与H因子的结合,从而使细菌易于被补体系统杀灭和清除。因此,f HBP已成为B群流行性脑脊髓膜炎理想的疫苗候选抗原之一。现就f HBP的结构、基因的表达与调节、作为B群脑膜炎奈瑟菌疫苗候选抗原的作用、应用策略、安全性和有效性等最新研究进展进行综述。

H因子结合蛋白抗原含量双抗夹心ELISA检测方法的优化与应用

目的优化双抗夹心-酶联免疫吸附法(double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测H因子结合蛋白(factor H-binding protein,fHBP)抗原含量的方法,并将其应用于重组B群脑膜炎球菌疫苗体外相对效力评价。方法筛选4种抗fHBP单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAb)适宜的抗体组合,通过方阵滴定法确定适宜的捕获抗体和酶标检测抗体稀释倍数、包被液、包被条件和显色时间,对优化后方法的专属性、线性、检测限、精密度和准确度进行了验证,并利用该方法检测fHBP蛋白相关制品的抗原含量。结果确定了适宜的双抗体检测组合以及试验条件(以柠檬酸缓冲液,4℃孵育16 h),在以柠檬酸缓冲液包被捕获抗体5.0000μg/mL、检测抗体1∶2000稀释、显色时间15 min的条件下,A450 nm-fHBP浓度曲线相关系数(r)>0.98,平行孔CV<10%,检测限<0.0002μg/mL,精密度<15%,准确度(直接回收率)<20%。亚家族之间抗原检测无干扰。多批fHBP相关制品检测结果稳定,差异无统计学意义(P>0.05)。结论优化后的方法可用于fHBP抗原含量的检定。

B群脑膜炎球菌H因子结合蛋白研究进展

H因子结合蛋白(factor H-binding protein, fHbp)是脑膜炎奈瑟菌(简称脑膜炎球菌)表面的一种关键毒力调节因子。fHbp通过与其配体H因子结合,使得脑膜炎球菌逃避人体免疫系统的识别和攻击,进而可在人体血液中生存,可引起脑膜炎和败血症等临床表现。由于B群脑膜炎球菌(Meningitidis serogroup B,MenB)荚膜多糖与人体神经组织具有相似性,因而荚膜多糖不适合作为疫苗的抗原成分。MenB疫苗大多采用蛋白疫苗的研发路线,研究人员通过反向疫苗学技术确定了fHbp及其他膜蛋白的免疫效果,其中fHbp是最有潜力的疫苗候选抗原成分,且该蛋白是目前已上市的MenB疫苗(Trumenba~?和Bexsero~?)的共有成分。现就fHbp作为MenB疫苗的抗原成分在疫苗中的研究进展作一概述。

响应面法优化产H因子结合蛋白的重组大肠埃希菌发酵条件

目的 使用响应面法(response surface methodology, RSM)对重组大肠埃希菌fHBP-B-1/BL21(DE3)的发酵条件进行优化,以提高目的蛋白表达量。方法 在单因素试验的基础上,利用Plackett-Burman试验筛选出对目的蛋白表达有显著影响的因素;再用最陡爬坡试验及Box-Behnken设计进一步优化试验条件并进行验证。结果 单因素试验结果显示,在酵母抽提物质量浓度为12.500 g/L、硫酸镁质量浓度为0.250 g/L、初始pH为6.00、诱导培养时间为8 h、诱导温度为35.00℃时,目的蛋白表达量最高,为363.04μg/mL。酵母抽提物质量浓度、硫酸镁质量浓度及诱导培养温度是影响目的蛋白表达量的显著因素。发酵条件优化后,酵母抽提物质量浓度为10.500 g/L、硫酸镁质量浓度为0.220 g/L、初始pH为6.00、诱导培养时间为4 h、诱导培养温度为37.50℃时,可以获得425.62μg/mL的目的蛋白,较单因素试验结果提高了17.25%。结论 重组大肠埃希菌fHBP-B-1/BL21(DE3)的发酵条件优化后,目的蛋白的表达量明显提升,为重组B群脑膜炎球菌疫苗后续工艺的开发奠定基础。

不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白表达的影响

目的探讨不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白(factor H-binding protein,f HBP)表达的影响。方法运用PCR方法将B群脑膜炎奈瑟菌f HBP原始信号肽分别替换为大肠埃希菌主要外膜脂蛋白(major outer membrane lipoprotein,MLP)、脂蛋白-28(lipoprotein-28,LP)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)P4外膜蛋白信号肽,并将其分别连接至p ET-30a表达载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达水平。结果替换了P4、LP和MLP信号肽的重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量较带原始信号肽的B群脑膜炎奈瑟菌f HBP相比,分别提高了2.68、1.94和2.91倍。结论替换MLP信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP蛋白表达的影响最大,为提高B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量的研究工作提供了新思路。

中国B群流脑菌株不同变异群H因子结合蛋白保护性抗原的筛选

目的筛选中国流行B群流脑菌株不同变异群的H因子结合蛋白(factor H binding protein,fHbp)的保护性抗原。方法根据中国流行病学数据选择6条中国流行B群流脑菌株不同变异群的fHbp抗原基因序列,优化合成后克隆构建原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,表达fHbp蛋白,经镍柱亲和纯化后,免疫BALB/c小鼠,检测其诱导产生的结合抗体和杀菌抗体反应。结果成功构建6个fHbp基因的原核表达质粒,纯化后的fHbp蛋白纯度均超过85%。6个抗原均可诱导产生平均抗体滴度超过1∶40000的结合抗体免疫反应,其中fHbp V2.18、fHbp V3.31和fHbp V3.94抗原可诱导针对fHbp V3.94菌株的杀菌抗体反应,fHbp V2.16和fHbp V2.18抗原可诱导产生针对fHbp V2.16菌株的杀菌抗体反应;确证试验显示,fHbp V2.18和fHbp V3.94抗原均可诱导产生针对fHbp V2.16和f Hbp V3.94菌株的杀菌抗体反应,肌肉免疫诱导产生的杀菌抗体反应高于腹腔免疫,其中fHbp V2.18抗原肌肉免疫诱导的针对f Hbp V2.16和fHbp V3.94菌株的平均杀菌抗体滴度分别为1∶134.4和1∶56,fHbp V3.94抗原肌肉免疫诱导的针对f Hbp V2.16和fHbp V3.94菌株的平均杀菌抗体滴度分别为1∶200和1∶1280。结论通过抗原筛选获得了可诱导杀菌抗体的中国流行B群流脑菌株的fHbp V2和V3抗原各2个,可用于后续B群流脑疫苗的研究。

响应面法优化fHBP-A蛋白双水相萃取工艺的探究

目的采用双水相萃取技术对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白A(fHBP-A)进行分离纯化,研究不同双水相萃取体系对fHBP-A粗提纯化的影响,应用响应面法优化fHBP-A在PEG/(NH_(4))_(2)SO_(4)双水相体系中的萃取工艺。方法首先建立PEG 2000/(NH_(4))_(2)SO_(4)、PEG 4000/(NH_(4))_(2)SO_(4)、PEG 6000/(NH_(4))_(2)SO_(4)和乙醇/(NH_(4))_(2)SO_(4)共4种双水相萃取体系相图;然后考察PEG相对分子质量、PEG质量分数、(NH_(4))_(2)SO_(4)质量分数、萃取体系pH这4个因素对fHBP-A萃取率、下相中fHBP-A纯度的影响;最后采用Box-Behnken试验设计以及响应面分析对fHBP-A双水相萃取工艺进行优化。结果确定fHBP-A双水相萃取的最佳工艺条件为PEG 4000质量分数为28%、萃取体系pH为6.0、(NH_(4))_(2)SO_(4)质量分数为13%。此条件下fHBP-A纯度达到68.11%。结论采用优化的工艺可以较好地提取及初步纯化fHBP-A,为进一步fHBP-A的纯化研究奠定基础。

脑膜炎球菌fHBP的克隆表达与免疫原性研究

目的选用pET蛋白表达系统重组表达A、B两个亚家族的fHBP蛋白(fHBP-A和fHBP-B),制备脑膜炎球菌蛋白疫苗,并对其进行免疫原性检测,评价该蛋白疫苗抵抗脑膜炎球菌感染的保护作用。方法以脑膜炎球菌Nm048(A家族)与Nm035(B家族)菌株裂解液为模版扩增目的基因fHBP-A与fHBP-B,与原核表达载体pET-24b连接,构建重组质粒pET-24b-fHBP-A和pET-24b-fHBP-B。分别用pET-24b-fHBP-A和pET-24b-fHBP-B转化大肠埃希菌,通过Western blot检测目的蛋白表达情况并用Ni^(2+)柱层析和凝胶过滤层析进行纯化。将家兔随机分为4组,fHBP-A实验组、fHBP-B实验组、fHBP-A+fHBP-B实验组用相应重组蛋白免疫,对照组注射PBS。采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测免疫家兔抗血清与靶菌的结合情况,通过血清杀菌力试验(serum bactericidal assay,SBA)评价该疫苗诱导的免疫保护效果。结果 PCR扩增出约760 bp的目的基因片段,经双酶切和测序鉴定重组质粒pET-24b-fHBP-A与pET-24b-fHBP-B构建成功.重组菌经IPTG诱导后采用Ni^(2+)柱层析和凝胶过滤层析纯化获得2个蛋白,纯度均>90%。分别用fHBP-A、fHBP-B及其混合产物免疫家兔制备的抗血清,滴度分别为1.8×10~4、4.9×10~5、4.8×10~5。经流式细胞术检测,不同抗原组合免疫抗血清均能与靶菌结合,血清杀菌力试验检测相应的杀菌效力均SBA>1∶8,其中fHBP-A+fHBP-B免疫抗原组抗血清的杀菌滴度较高且具有交叉反应。结论 2个亚家族的fHBP蛋白疫苗能诱导家兔产生较强的体液免疫,fHBP-A+fHBP-B具有较好的免疫原性,为脑膜炎球菌蛋白疫苗的研发奠定了基础。

中国B群脑膜炎奈瑟菌分子流行病学特征分析

目的分析中国B群脑膜炎奈瑟菌分子流行病学特征。方法485株B群脑膜炎奈瑟菌为1968—2016年分离和收集于29个省份的菌株,包括流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例脑脊液或血液标本分离菌株100株,健康带菌者鼻咽部分离菌株385株。根据多位点序列分型(MLST)网站公布的方法,对菌株进行PorA外膜蛋白分型和MLST分型,采用Bionumerics软件分析序列型(ST型),构建最小生成树;针对B群脑膜炎奈瑟菌蛋白疫苗的主要成分FHbp、NadA和NHBA蛋白进行分子型别分布和序列特征分析。结果485株B群脑膜炎奈瑟菌分为270种ST型,其中107种ST型(211株菌)可归入已知的10个克隆群,163种ST型(274株)不能归入任何克隆群;CC4821为主要流行的克隆群(28.7%,139株)。病例分离菌株的主要PorA型为P1.5-2,2-2(10.0%,10株)、P1.5-1,2-2(9.0%,9株)和P1.5-1,10-4(9.0%,株)。421株含有完整的FHbp氨基酸序列,其中变异1型(v1)、2型(v2)和3型(v3)菌株分别占12.8%(54株)、85.0%(358株)和2.2%(9株)。432株完成nadA基因测序,其中10株(2.3%)含有完整的nadA基因。172株完成nhba基因测序,均具有完整的nhba基因序列,其中170株的NHBA氨基酸序列共分为68个型,呈现出多态性特征。结论中国B群脑膜炎奈瑟菌优势克隆群为CC4821;其疫苗相关蛋白多态性较强。中国应该根据本国菌株的特征慎重选择B群流脑疫苗候选蛋白。

脑膜炎奈瑟菌病原学研究进展

本文综述了脑膜炎奈瑟菌生物学特征、致病性和B群脑膜炎球菌疫苗蛋白抗原研究进展,包括细菌分类、荚膜多糖表达及调控、生物膜形成及H因子结合蛋白(fHbp)等。重点阐述了fHbp结构、分类、功能和表达调控,以期为中国B群脑膜炎球菌疫苗研发提供参考。