温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

H型微血管在骨形成中的作用机制和研究进展

骨形成和血管新生是一个相互耦联的过程。最近在鼠科动物骨骼中新发现H型微血管(CD31hiEmcnhi),它可以调节骨骼血管密度,维持血管周围骨祖细胞活性,耦联血管新生和骨形成。Notch-Dll4信号可能是血管-成骨耦联的关键信号通路,激活Notch信号可促进H型微血管内皮细胞增殖和血管生成。H型微血管同时可分泌Noggin蛋白,调节骨祖细胞活性,恢复软骨细胞功能,重建骨小梁。

大鼠股骨干骺端H型微血管网的观测研究

目的探讨和建立稳定的大鼠股骨干骺端内H型微血管的观测方法。方法2019年3月至2019年9月,15只无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠,购自南方医科大学动物实验中心,简单随机抽样分5组:25μm组(A组),50μm组(B组),70μm组(C组),100μm组(D组),150μm组(E组)。取后肢股骨,经固定、脱钙、脱水、包埋等,形成5组厚切片,免疫荧光特异性标记CD31显示微血管,比较不同厚度下股骨干骺端内微血管网血管平均面积占比、节点数目、血管总长度等指标,确立最佳观测厚度,在此基础上,CD31和Emcn双染观测H型微血管情况。应用Angio Tool软件分析骨内微血管网指标,SPSS 17.0软件行统计分析,计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用最小显著性差异法(LSD)分析。结果A^E组5组血管平均面积占比分别为(20.6±1.6)%、(31.0±1.4)%、(45.9±0.8)%、(31.8±1.1)%、(20.9±0.7)%,C组平均面积占比明显高于其余4组(F=313.642,P<0.01),差异有统计学意义。A^E组5组节点数目分别为(103±6)、(175±6)、(305±5)、(151±6)、(45±3)个,C组节点数目明显高于其余4组(F=1278.134,P<0.01),差异有统计学意义。A^E组5组血管总长度分别为(14300±956)、(19215±439)、(24492±565)、(19071±893)、(12799±561)μm,C组微血管总长度明显高于其余4组(F=12.532,P<0.01),差异有统计学意义。C组显示骨内完整微血管网,股骨干骺端骨CD31和Emcn双染标记显示特异性H型微血管。结论70μm厚度下可满足微血管网的定量分析,实现对大鼠股骨干骺端H型微血管的准确观测。