家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。

北京长白杂交猪IgGH链基因CH2-CH3的克隆、序列分析及表达质粒构建

根据GenBank中注册的猪IgG H链基因cDNA CH2 CH3序列(SSU03780),设计了含KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从北京长白杂交猪肠系膜淋巴结细胞扩增猪IgG H链基因CH2 CH3序列.将PCR产物纯化回收后,插入到含LacZ基因的克隆载体pGEM-T Easy中,转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆.将所克隆的目的片断亚克隆到原核表达载体pQE 30,构建重组质粒pQE 30/PIgG CH2 CH3.将重组表达质粒转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.结果表明,本研究克隆了猪IgG H链基因CH2 CH3序列,全长663 bp,编码221个氨基酸,利用Gentyx version 6.0软件将CH2 CH3基因的核苷酸序列与GenBank中的参考序列比较,其核苷酸序列同源率为99.551%,推导的氨基酸序列同源率为100%.将pQE 30/PIgG CH2 CH3转化JM 109感受态细胞,表达的融合蛋白相对分子质量约为26.95 ku,经IPTG诱导2 h,表达量约占菌体总蛋白41.5%.

猪IgG H链基因CH2-CH3的克隆和分析

根据已发表的猪IgG H链序列,设计了1对通用引物,从猪外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IgG H链基因CH2-CH3序列,并克隆入pMD18-T Simple载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经SalI和XbaI双酶切鉴定,筛选出阳性克隆。核酸序列测定分析表明,IgG H链基因CH2-CH3序列全长为669 bp,编码CH2-CH3的221个氨基酸和J区的1个脯氨酸。利用DNASTAR软件将其与猪IgG H链各CH2-CH3序列进行比较,发现其与U03778-1、U03779-2a、U03780-2b、U03781-3、U03782-4的核苷酸序列同源率分别为92.1%、98.4%、98.5%、93.0%和97.2%,推导的氨基酸序列同源率分别为86.5%、96.4%、96.5%、87.0%和94.2%。经进化树分析提示,该序列可能为一个新的亚型。

家蚕丝心蛋白H链基因的荧光原位杂交(FISH)

蚕丝业在国民经济中占有极为重要的地位.家蚕作为重要的模式生物和生物反应器,历来为人们所关注.有关蚕丝基因的结构、表达调控和分子进化都已有较详细的研究和报道,但关于蚕丝结构基因的分子细胞遗传学基因定位的研究,几乎尚无报道.经用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）对家蚕丝心蛋白H链基因（Fib-H）的分子细胞遗传学定位研究结果,初步将家蚕丝心蛋白H链基因定位在了分子细胞遗传学第25连锁群染色体的端部,即25～0.0的位置,从而解决了该基因迄今尚未定位的问题,并证实了丝心蛋白H链基因在染色体位置上为单一座位.

LncRNA H19基因多态性与乳腺癌遗传易感性关联的Meta分析

目的系统评价长链非编码RNA(LncRNA)H19基因rs217727和rs2839698单核苷酸多态性(SNP)位点与乳腺癌遗传易感性的关系。方法检索PubMed、Embase、Elsevier、中国知网(CNKI)、万方数据库、维普(VIP)数据库,收集关于LncRNA H19基因多态性与乳腺癌遗传易感性相关的病例对照研究。采用STATA12.0软件Meta-analysis模块进行LncRNA H19基因多态性与乳腺癌遗传易感性关联的Meta分析。结果关于rs217727 SNP位点的5篇文献共纳入乳腺癌患者3178例,健康对照者3392例;关于rs2839698 SNP位点的3篇文献共纳入乳腺癌患者2607例,健康对照者2827例。Meta分析结果显示,rs217727与rs2839698 SNP位点4种遗传学模式[等位基因(T vs.C)、加性模式(TT vs.CC)、隐性模式(TT vs.CT+CC)、显性模式(TT+CT vs.CC)]在病例组与对照组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。人群分层研究显示,中国汉族人群和伊朗人群rs217727 SNP位点4种遗传学模式在病例组与对照组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。中国汉族人群rs2839698 SNP位点4种遗传学模式在病例组与对照组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。伊朗人群rs2839698 SNP位点4种遗传学模式在病例组与对照组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论中国汉族人群LncRNA H19基因rs217727和rs2839698 SNP位点4种遗传学模式与乳腺癌遗传易感性无关。

贝伐单抗结合培美曲塞与顺铂化疗对非小细胞肺癌患者血清lncRNA H19及lncRNA HOTAIR表达的影响

目的探讨贝伐单抗结合培美曲塞与顺铂化疗对非小细胞肺癌患者血清lncRNA H19及lncRNA HOTAIR表达的影响。方法选择非小细胞肺癌患者150例,根据患者的治疗方案分为观察组和对照组各75例。对照组基于培美曲塞联合顺铂治疗,观察组给予贝伐单抗联合培美曲塞与顺铂治疗,两组均治疗4个疗程后观察治疗效果、免疫功能、细胞因子及lncRNA H19、lncRNA HOTAIR水平。结果治疗后观察组治疗效果显著高于对照组(P<0.05);治疗后两组血管内皮生长因子(VEGF)-A、VEGF-B、VEGF-C水平均显著下降,且观察组下降更显著(P<0.05);治疗后两组CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平明显提高,Treg、CD8^(+)细胞水平明显下降,且观察组改善更显著(P<0.05);治疗后两组干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-4、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平显著升高,转化生长因子(TGF)-β水平均显著下降,且观察组改善更显著(P<0.05);治疗后两组印迹基因H19长链非编码RNA(lncRNA H19)、同源盒基因转录长链非编码RNA(lncRNA HOTAIR)水平均显著下降,且观察组下降更显著(P<0.05);两组不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05);结论贝伐单抗结合培美曲塞与顺铂治疗非小细胞肺癌患者的治疗效果较好,并且可改善机体免疫功能,改善细胞因子水平,降低lncRNA H19、lncRNA HOTAIR水平,在临床上可广泛使用。

孕期慢性应激对子代雌性大鼠抑郁样行为及印记基因IGF-2/H19甲基化的影响

目的探究孕期慢性应激对子代雌性大鼠抑郁行为及海马组织印记基因胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)/长链非编码RNA(lncRNA)H19甲基化的影响。方法32只SPF级雌性SD大鼠按照随机数字表法分为模型组和对照组,模型组大鼠采用慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress model,CUMS)方法建立抑郁模型,对照组正常饲养。应激刺激第7天时,雌雄鼠合笼交配。在应激刺激前1 d和应激刺激第1、7、14、21、28天对两组母鼠行内眦静脉采血,测定血浆皮质酮浓度;在雌性仔鼠出生后第28天和出生后第42天时,每组随机抽取8只,行内眦静脉采血后测定血浆皮质酮浓度;在出生后第42天时,分别通过糖水偏爱实验、悬尾实验和强迫游泳实验测定两组雌性仔鼠的抑郁样行为。采用RT-PCR和Western blot法检测仔鼠海马组织中IGF-2/H19及相关转移酶表达情况。利用Methyl Target技术,对IGF-2差异性甲基化区域(differentially methylated region,DMR)片段2的19个CpG位点,H19印记控制区(imprinting control region,ICR)片段1中8个CpG位点和H19-ICR片段2的15个CpG位点,同时捕获测序,计算每个CpG位点甲基化水平。采用SPSS 26.0,采用重复测量方差分析、t检验和非参数检验对相关数据进行统计分析。结果(1)重复测量方差分析结果显示,母鼠血浆皮质酮的时间与组别的交互效应不显著(F=2.997,P=0.066),时间主效应显著(F=4.44,P=0.010),组别主效应显著(F=41.40,P=0.001)。组间因素的单独效应分析,在应激第14、21、28天,模型组母鼠血浆皮质酮浓度均高于对照组母鼠(均P<0.001)。(2)在糖水偏爱实验中,模型组雌性仔鼠的液体总消耗[11.10(10.38,11.58)mL,13.55(12.00,15.77)mL,Z=-3.055,P=0.002]、1%蔗糖水消耗[(5.50±1.30)mL,(8.56±2.04)mL,t=-3.582,P=0.003]及1%蔗糖偏爱百分比[(51.35±8.69)%,(62.11±8.05)%,t=-2.576,P=0.022]均低于对照组。(3)模型组雌性仔鼠悬尾实验中静止持续时间[(126.95±39.89)s,(54.30±25.00)s,t=4.375,P=0.001]和强迫游泳实验中持续不动时间[(7.97±6.66)s,(1.85±2.12)s,t=2.478,P=0.037]均长于对照组。(4)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 mRNA[(0.46±0.24),(1.00±0.00),t=3.821,P=0.019]、H19 mRNA[(0.60±0.25),(1.00±0.00),t=3.574,P=0.007]表达均低于对照组;模型组雌性仔鼠IGF-2蛋白相对表达低于对照组[(0.77±0.04),(1.00±0.00);t=9.876,P=0.01);CCTC结合因子(CCTC-binding factor,CTCF)的mRNA[(1.29±0.12),(1.00±0.00),t=-4.850,P=0.003]和蛋白相对表达水平[(1.90±0.28),(1.00±0.00),t=-5.513,P=0.005]均高于对照组。(5)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 DMR区域3个CpG位点甲基化水平均低于对照组(t=-3.21,-3.00,-3.34,均P<0.05),分别位于chr1215831028、chr1215831055和chr1215831205;IGF-2 DMR片段甲基化水平低于对照组(t=-3.453,P=0.048);模型组雌性仔鼠甲基转移酶DNMT3A mRNA(t=5.102,P=0.002)、DNMT3A(t=10.213,P<0.001)和DNMT3B(t=4.169,P=0.014)蛋白相对表达水平均低于对照组。结论孕期慢性应激致雌性仔鼠出现抑郁、绝望状态,其机制可能与甲基化转移酶表达降低引起印记基因IGF-2 DMR甲基化水平降低有关。