强迫劳动、契约奴役与不自由劳动——美国H-2A客工计划对工人权利的侵犯

H-2A农业客工计划是美国政府推动出台的一项制度,旨在通过允许本国农业雇主与外国工人签订短期合同来解决美国国内农业劳动力短缺的问题。H-2A客工现已成为美国农业劳动力的重要组成部分,然而,在H-2A农业客工计划实际运作中,工人的基本权利遭到各种侵害。客工计划中的工人没有更换雇主的权利,他们的行动自由受到严格限制,工资极低且遭到克扣,同时遭受着雇主的各种虐待以及强迫劳动。H-2A农业客工计划虽尚未构成契约奴役或系统性强迫劳动,却是一种极不自由的劳动形式。客工深陷于这种极不自由的劳动关系中,且缺乏基本的救济途径。为从根本上解决此问题,美国政府应尽快废弃农业客工计划或对客工计划进行全面改革,赋予外国工人更换雇主的权利,取消黑名单制度,并给予外国工人以平等的法律保护。

可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体。方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-22b高效表达载体多克隆位点,诱导表达后对表达产物进行纯化,用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2Kd原核表达载体,测序证实H-2Kd-BSP融合基因序列正确。pET-H-2Kd原核表达载体可在大肠杆菌BL21中高效诱导表达H-2Kd-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的36%,主要以包涵体形式表达;经反复洗涤纯化,纯化蛋白纯度可达90%以上。纯化蛋白可被H-2Kd分子特异性单克隆抗体SF1-1.1所识别。结论可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2Kd-肽四聚体奠定了实验基础。

H-2A&H-2B:日本火箭的中流砥柱

在H-2 型火箭由于 1998 年的部分失败和 1999 年的发射失利而遗憾退役后,日本宇宙开发事业集团决定将新一代火箭的研发周期拉长,针对事故中总结出的经验和教训,建立起更为完善、严格的研制与评估体系;增加、加强研制过程中各个组件的测试工作;通过更加严密的质量管控来确保新一代运载火箭不重蹈覆辙.

MicroRNA-155在碘致NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎发病中的变化研究

目的:观察高碘诱发NOD.H-2 h4小鼠发生自发性自身免疫性甲状腺炎(SAT)动物模型中Th1及Th2细胞的动态变化及甲状腺、脾脏、肝脏、肾脏中mi R-155的动态改变,探讨mi R-155对碘致自身免疫性甲状腺炎(AIT)的可能影响及作用机制。方法:4周龄NOD.H-2 h4雌性小鼠随机分为对照组及高碘饮水组。高碘组饲以含0.05%碘化钠的无菌水,对照组饲以无菌双蒸水,于实验开始后第0、2、4、6、8、10、12周麻醉处死。留取甲状腺,制备石蜡切片行HE染色;酶联免疫吸附试验测定血清甲状腺球蛋白抗体(Tg Ab)水平;流式细胞仪检测脾脏单个核细胞悬液Th1、Th2细胞表达水平;实时定量RT-PCR检测脾细胞中Th1和Th2细胞转录因子T-bet及GATA-3,细胞因子IFN-γ及IL-4的m RNA表达水平及甲状腺、脾脏、肝脏、肾脏mi RNA-155表达水平。结果:发生SAT的小鼠血清Tg Ab滴度较对照组升高(P<0.05)。脾细胞中Th1细胞比例及T-bet,IFN-γm RNA表达量自6周后较对照组升高(P<0.05)。脾脏、甲状腺miR-155表达量分别自8周及10周后较对照组升高(P<0.05)。脾脏mi R-155水平与Tg Ab滴度显著正相关(r=0.825,P<0.01),与Th1细胞比例显著正相关(r=0.872,P<0.01);甲状腺mi R-155水平与TgAb滴度显著正相关(r=0.575,P<0.01);与Th1细胞比例显著正相关(r=0.642,P<0.01)。结论:发生SAT的NOD.H-2 h4小鼠脾脏Th1细胞比例显著升高,提示Th1细胞可能参与该模型AIT的发生发展,占免疫优势地位。脾脏及甲状腺mi R-155水平与Tg Ab滴度及Th1细胞比例显著正相关,提示mi R-155可能通过影响Th1细胞在AIT的发生发展中发挥作用。

小鼠肝素酶H-2K^b限制性CTL表位预测及其MHC-I亲和力分析

目的预测肿瘤转移相关基因肝素酶的CTL表位,为探索基于肝素酶的抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法利用基于超基序、量化基序结合人工神经网络方案开发的H-2Kb限制性CTL表位预测软件,对小鼠肝素酶蛋白的CTL表位进行预测,然后人工合成相关待测表位肽,再对这些合成肽与MHC-I结合亲和力进行检测。结果采用机算机网络系统,预测了5条小鼠肝素酶抗原表位,即mHpa234~241(LGEDFVEL),mHpa351~358(FAAGFMWL),mHpa519~526(FSYGFFVI),mHpa386~393(VDENFEPL),mHpa398~405(LSLLFKKL),MHC亲合力实验表明,与阴性对照肽对比,随着预测肽浓度增加,H-2Kb的表达逐渐增加,与MHC-Ⅰ类分子的亲和力亦逐渐增强,当预测肽浓度达到30μmol/L时,其荧光系数(FI)均大于1.5。结论通过计算机软件预测到的5条小鼠肝素酶CTL表位与MHC-Ⅰ类分子均有较高的结合亲和力,为该表位的下一步体内鉴定及基于小鼠肝素酶抗原表位的肿瘤免疫治疗奠定基础。

小鼠H-2半相合非清髓同种异基因造血干细胞移植模型的建立及其相关研究

为了探讨小鼠主要组织相容性抗原 (H 2 )半相合非清髓移植中预处理方案的可行性、移植后的造血重建、嵌合体水平及GVHD的发生情况 ,以CB6F1小鼠为受鼠 ,分为 3组 ,移植前 5天开始给予预处理 ,A组给予清髓(10 .5Gy)预处理方案 ,B组给予全身照射 (2Gy) +Ara C +Cy ,C组为全身照射 (2Gy) +Ara C +Cy +Flu ,对所有受鼠均未进行GVHD防治。所有受鼠在第 0天经尾静脉注射C5 7BL 6小鼠混合细胞悬液 (2× 10 7骨髓细胞 +1×10 7脾细胞 ) ,然后观察其造血恢复、植入及移植物抗宿主病 (GVHD)的情况。结果表明 :A组植入结果始终为完全供者型嵌合体 ,B和C组则为混合型或完全供者型嵌合体 ,其中B组混合嵌合体保持在 80 %以下 ,且在移植 5 0天以后有下降趋势 ,而C组嵌合体水平保持在 80 %以上 ,其嵌合接近或为完全供者型 ,移植 5 0天以后仍保持稳定。由于没有给予GVHD防治措施 ,各组均发生不同程度的GVHD ,其中A组受鼠GVHD的发生率和死亡率明显高于B和C两组 (P≤ 0 .0 1) ,但B和C两组之间无显著差异。结论 :以氟达拉宾为主的非清髓预处理方案 ,能够在受者体内形成稳定且持久的植入 ,并通过在受者体内形成混合性嵌合体 ,诱导供体对受体的特异免疫耐受 ,减少或避免GVHD的发生。

H-2K^b-BSP融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 构建可生物素化Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合基因的表达载体。方法 采用 ＰＣＲ技术，从 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋） Ｋ～ｂ中扩增出Ｈ－２Ｋ～ｂ基因的胞外区，拼接上依赖 ＢｉｒＡ酶的可生物素化序列后，克隆人ｐＥＴ－４２ｂ（＋）高效表达载体进行诱导表达。并对表达产物进行纯化与复性。结果 成功地构建了融合表达载体ｐＥＴ－Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ，对表达产物进行纯化与复性，并应用仅识别完整构象的抗Ｋ～ｂ分子的单克隆抗体对复性后产物进行了检测。证明表达产物已部分恢复了构象。结论 获得Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合蛋白的高效表达，为研究在原核系统中表达、纯化与复性，以及进一步利用亲和素在体外构建ＭＨＣ－Ｉ类分子四聚体，探讨免疫识别机制奠定了基础。

H-2D^b四聚体的制备及其在检测LCMV特异性CD8^＋T细胞中的应用

MHC四聚体技术是研究抗原特异性淋巴细胞应答的关键技术之一。为研究H-2D^b基因型(如C57BL/6)小鼠的特异性CD8^+T细胞免疫应答,需要建立H-2D^b四聚体制备技术平台。首先以RT-PCR方法克隆H-2D^b重链基因的cDNA,进而构建H-2D^b胞外域与生物素化酶BirA底物肽(BSP)融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。在LCMV GP_(33-41)抗原肽(KAVYNFATC,KAV)和人β_2-微球蛋白存在时,通过稀释法复性获得H-2D^b/KAV单体。该单体经生物素化并纯化后与PE-链亲和素按4:1的比例混合,即形成四聚体。通过流式细胞术检测经KAV肽免疫的C57BL/6小鼠体内的LCMV特异性CD8^+T细胞的频率.结果表明在外周血、引流淋巴结和脾脏中均可检测到一定频率的LCMV特异性CD8^+T细胞,其中以对外周血标本染色的效果最佳。成功建立了小鼠H-2D^b四聚体制备技术平台,为监测及分析基于H-2D^b基因型小鼠的实验性免疫治疗创造了条件。

实验小鼠H-2抗原单克隆抗体的效价研究

目的 研究实验小鼠H - 2抗原单克隆抗体在初建时和经冷冻保存后的效价变化规律 ,为长期保存小鼠H - 2抗原单抗及规模性推广这一遗传监测方法奠定技术基础。方法 制备 6种抗小鼠H 2抗原的单克隆抗体 ,将具备一定抗体效价 (16 0倍以上 )的细胞株保存在 - 196℃的液氮中 ,数月后将复苏后的部分细胞株培养 4 8h后 ,取其上清液用微量细胞毒试验法测定抗体的效价 ,并与其原有效价进行比较。结果 单抗初建时效价达到 16 0倍以上的细胞株占总株数的 37%～ 5 3% ,H 2K抗体复苏后效价持平的细胞株占 13% ,效价下降的为 74 % ,效价上升的是 13% ;H 2D抗体效价持平的细胞株占 5 3% ,下降的为 31% ,上升的是 16 %。复苏后的抗体效价大部分与原效价持平或略有下降 ,个别的会有所提高。结论 单克隆抗体的效价略低于同种单价特异性抗血清 ;能否使冻存后的抗体保持原有的效价是抗体能否大量生产并推广的关键 ;要长期保存和生产H 2抗原单抗 ,应加强克隆和检测工作 ,建立稳定的制备、保存和检测系统 。

MicroRNA-146参与碘诱导NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎

目的:观察自身免疫性甲状腺炎(AIT)NOD.H-2h4小鼠microRNA-146(miR-146)的表达水平。方法:选取4周龄NOD.H-2h4雌性小鼠随机分为正常饮水(无菌双蒸水)组和高碘饮水(0.05%碘化钠水)组。甲状腺HE染色观察淋巴细胞浸润情况;获取CD4^+ T细胞及甲状腺组织small RNAs,RT-PCR检测miR-146表达水平;检测心、肝和肾中miR-146的表达水平。结果:高碘饮水组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润,甲状腺炎的发生率均高于对照组。与对照组相比,高碘饮水组小鼠脾脏CD4^+ T细胞和甲状腺中miR-146水平显著升高。高碘饮水组小鼠与对照组相比,心、肝和肾中miR-146的水平没有明显差别。结论:在NOD.H-2h4小鼠AIT模型中,甲状腺和脾脏CD4^+ T miR-146水平升高,可能参与自身免疫性甲状腺炎的发生和发展。

Fcgr2b基因及H-2复合体对SLE模型小鼠IgG抗体产生的调节作用

目的:分析Fcgr2b基因对SLE小鼠血清总IgG抗体产生的影响;Fcgr2b基因单独及Fcgr2b基因与H-2复合体共同作用对SLE小鼠血清IgG抗DNA抗体产生的调控。方法:建立(NZB×NZW)F1×NZW回交小鼠模型,用特异性荧光抗体染色,流式细胞术检测及PCR技术进行基因分型,以ELISA法测定血清总IgG及抗DNA抗体水平进行分析比较。采用扩增片段长度多态性(AmpFLP)分析NZB,NZW小鼠Fcgr2b基因启动子区是否有多态性。结果:(NZB×NZW)F1×NZW回交小鼠Fc-gr2b基因B/W型组血清总IgG水平明显高于W/W型组(P<0.0001)。Fcgr2b基因独作用时,回交小鼠Fcgr2b基因B/W型组与W/W型组间血清IgG抗DNA抗体水平差异不显著(P>0.05)。Fcgr2b基因与H-2复合体共同作用时,H-2复合体为d/z型时,无论Fcgr2b基因是B/W型或W/W型,其血清IgG抗DNA抗体水平明显高于含H-2复合体Z/Z型组(P<0.01);H-2复合体为d/z型时,含Fcgr2b基因B/W型组血清IgG抗DNA抗体水平明显高于W/W型组(P<0.01)。NZB小鼠Fcgr2b基因启动子区扩增片段长度短于非自身免疫病小鼠NZW,C57BL/6及BALB/c小鼠,提示可能存在碱基缺失。结论:血清总IgG水平由Fcgr2b基因调控;IgG抗DNA抗体产生主要由H-2复合体调控,Fcgr2b基因单独作用对该抗体产生的影响不明显,但与H-2复合体具有协同作用。

小鼠肝素酶H-2Kb限制性CTL表位的实验鉴定

目的实验鉴定H-2Kb限制性小鼠肝素酶(mHpa)CTL表位。方法5条mHpa表位分别负载C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞,并进一步诱导产生表位特异性的效应细胞,采用标准4 h51Cr释放试验检测效应细胞对不同靶细胞的免疫杀伤效应;采用ELISPOT检测效应细胞分泌IFN-γ的能力。结果5条mHpa CTL表位中,仅mHpa398-405和mHpa519-526可以诱导小鼠产生特异性CTL,对同来源的B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞和EL-4淋巴瘤细胞具有明显的免疫杀伤效应,而对H-2Kb阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有免疫杀伤效应,进一步研究发现,上述多肽特异性CTL对自体淋巴细胞和DC细胞不具有杀伤效应,另一方面,mHpa398-405和mHpa519-526还可促进效应细胞分泌IFN-γ的能力。结论mH-pa398-405、mHpa519-526为小鼠肝素酶来源且受H-2Kb限制性CTL表位,小鼠体内可以诱导产生表位特异性的CTL反应。

615小鼠H-2K^k基因cDNA的克隆及序列测定和分析

目的 :克隆 6 15小鼠主要组织相容性复合体 (MHC)Ⅰ分子抗原识别基因H_2Kk 并测序分析 ,为转基因治疗提供目的基因。方法 :采用RT_PCR法从 6 15小鼠肝组织总RNA中获得 1 4kb的H_2Kk 基因cDNA ,将其定向连接至PGEM3Zf(+)载体 ,转化E coliJM10 9,限制性内切酶筛选出阳性克隆PGEM3Zf(+)_H_2KkcDNA ,末端终止法完成H_2KkcDNA的全序列测定。结果 :测得的H_2KkcDNA序列与文献报道序列同源性高达 99% ,编码MHCⅠ分子抗原识别部位的氨基酸残基的核苷酸序列完全相同。结论 :成功克隆了 6 15小鼠MHCⅠ分子抗原识别基因 。

微波辐射合成2-苯基-1H,1'H-2',5-双苯并咪唑

采用微波辅助,以3,4-二氨基苯甲酸和苯甲醛为原料,合成了2-苯基-1H,1'H-2',5-双苯并咪唑。探讨了物料比、微波输出功率、微波辐射时间和催化剂PPA与HCl比例对反应产率的影响。结果表明,第1步较佳反应条件为3,4-二氨基苯甲酸︰苯甲醛=1.0︰1.2,微波输出功率320W,间歇辐射30min;第2步较佳反应条件为5-(2-苯基-1H-苯并咪唑)甲酸︰邻苯二胺=1.0︰1.1,PPA/HCl=1︰1,微波输出功率500W,间歇辐射15min。该方法具有原料消耗少、操作简单、反应条件温和、易纯化、对环境无污染、产率高的优点。

Southern杂交方法用于近交系小鼠H-2基因检测

目的建立一种简便、快捷、准确的检测方法用于近交系小鼠的遗传检测。方法根据近交系小鼠的H-2基因序列设计相应的探针,并标记生物素,利用微孔板Southern杂交技术,使探针与模板DNA杂交,再加入亲和素标记的辣根过氧化物酶进行酶显色反应,通过酶标仪检测杂交结果,以确定近交系小鼠的基因型。结果57BL/6和C57BL/10为H-2b型;DBA/2和Scid为H-2d型;615和C3H为H-2k型;NCPC/2、TA1、TA2和T739均为H-2b型。结论通过Southern杂交检测可以确定近交系小鼠的基因型。该检测方法简便、易行,检测结果客观,可以应用于近交系小鼠的遗传检测。

NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎中细胞凋亡及凋亡相关蛋白Fas、Fas-L和FLIP的表达

目的观察NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎时甲状腺内细胞凋亡和凋亡相关蛋白Fas、Fas-L和FLIP的表达情况,研究细胞凋亡在自身免疫性甲状腺炎中的作用。方法7~8周龄的NOD.H-2h4小鼠,饲以0.05%NaI溶液作为实验组,对照组小鼠则饲以自来水。在给碘后8,16,32周处死小鼠,HE染色观察甲状腺的炎症程度,TUNEL方法观察甲状腺内细胞凋亡情况,免疫组化方法观察凋亡相关蛋白Fas、Fas配体(Fas-L)和FLICE抑制蛋白(FLIP)的表达情况。结果实验组小鼠出现自身免疫性甲状腺炎,对照组无甲状腺炎产生。甲状腺炎时,TUNEL染色阳性细胞主要集中在浸润淋巴细胞中,甲状腺滤泡上皮细胞罕见凋亡;Fas、Fas-L和FLIP主要表达在甲状腺内的浸润淋巴细胞上;部分甲状腺滤泡上皮细胞表达Fas,而Fas-L和FLIP在甲状腺滤泡上皮细胞未见明显表达。结论NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎时甲状腺细胞无明显凋亡,提示细胞凋亡机制未参与甲状腺炎的发病。甲状腺内浸润淋巴细胞虽然表达Fas但并未出现明显凋亡,这可能与其同时表达抗凋亡蛋白FLIP有关。

H-2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的克隆H－2KbcDNA及研究其在多种真核细胞中的表达。方法RT－PCR法扩增H－2KbcDNA，克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN，PA317包装出重组病毒后，分别感染NIH3T3、COS7及MM45T．Li，PCR和RT－PCR分析目的基因表达，FACS分析H－2Kb在细胞膜上的表达。结果以双顺反子逆转录病毒载体pGCEN介导，分别建立了H－2Kb基因转导细胞：NIH3T3／Kb、COS7／Kb及MM45T．Li／Kb。PCR结果表明目的基因已存在于宿主细胞中，RT－PCR结果表明目的基因已获得正确表达。FACS结果表明H－2Kb分子已稳定表达在细胞膜表面。结论MHC分子基因在多种真核细胞中的表达为研究抗原递呈及抗肿瘤作用提供了基础。

富碘中药复方与碘过量对碘缺乏NOD.H-2^(h4)小鼠心、肾2型脱碘酶mRNA表达的影响

目的:研究富碘中药复方及碘过量对于碘缺乏NOD.H-2h4小鼠心、肾2型脱碘酶(D2)mRNA表达的影响。方法:选雌性8周龄NOD.H-2h4小鼠,给予双蒸水及低碘饲料喂养90d后制成碘缺乏自身免疫性甲状腺炎易感的甲状腺肿模型。随机分为正常对照组(NC)、低碘组(LI)、碘过量组(IE)(碘酸钾配制的含碘1900μg/L的去离子水)、富碘中药复方组(HIE)(海藻15g、昆布15g、海带7.5g,碘含量1900.36μg/L)。给予处理因素90d后处死。应用放射免疫RIA法测小鼠血清总T3(TT3)、总T4(TT4)。IRMA法测定小鼠血清促甲状腺激素(TSH)。光镜观察甲状腺组织细胞形态。应用实时定量RT-PCR法测定小鼠心、肾D2mRNA的表达情况。结果:给予处理因素90d后,各组间血清TT3,TT4及TSH值比较均未见明显差异(P>0.05)。NC、LI、IE与HIE组小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生率分别为:2/10、0/10、9/10、3/10。小鼠心D2mRNA的表达,LI组(1.76±0.34)与NC组(1.02±0.25)相比有明显的升高趋势(P<0.01),IE组(1.42±0.33)的表达显著高于HIE组(0.76±0.32)的表达(P<0.05);小鼠肾D2mRNA的表达,IE组(4.07±0.88)较HIE组(1.91±0.62)升高趋势明显(P<0.01)。结论:摄碘量相同的情况下,单纯碘过量可致NOD.H-2h4小鼠心、肾D2表达增加,富碘中药复方亦可致小鼠肾D2表达增加,小鼠心中未见此变化。

高脂诱导的C57BL/6 (H-2b)2型糖尿病小鼠十二指肠空肠旷置术模型的建立

目的：探讨建立一种C57BL／6（H-2b）高脂诱导的2型糖尿病小鼠保留全胃的十二指肠空肠旷置术（DJB）新型降糖术式动物模型的可行性和操作要点。方法：16只C57BL／6（H-2b）高脂诱导的2型糖尿病小鼠随机分为实验组和对照组各8只，规范的术前、术中及术后操作，实验组和对照组分别行DJB和假手术，比较两组小鼠术前及术后7、14、28d平均空腹血糖，评价手术造模是否成功以及成活率。结果：术后1-28d对照组小鼠存活7只，手术组小鼠成活6只，两组成活率差异无统计学意义（P〉0．05）；与术前比较，实验组术后7d空腹血糖明显下降（P〈0．05），术后14、28d血糖趋于稳定，对照组空慢血糖术后第14、28天与术前比变化无统计学意义（P〉0．05），提示模型建立成功。结论：成功地建立C57BL／6（H-2b）高脂诱导的2型糖尿病小鼠DJB动物模型。十二指肠空肠旷置术是一种可行、安全有效的降糖术式，规范实验操作程序可以降低术中风险。

H-2过滤装置的制作与应用

为保证外伤性血胸自血回输的安全和易操作性 ,自制 H- 2过滤装置 ,对 5 6例病人实施自体胸血回输 ,在H- 2过滤装置滤过前后抽取血标本作血常规检验和细菌培养。结果胸血过滤前后血液成分无显著变化 (均 P>0 .0 5 ) ,血液无污染 (细菌培养阴性 ) ,回输后未发生不良反应。 H- 2过滤装置能滤去组织碎屑等微粒 ,使引血、滤血、集血等过程一次完成 ,密封性好 ,使用安全 ,可在临床推广。