绿色荧光蛋白与H-2K^b融合基因的构建及表达

目的 构建GFP与H 2Kb 融合基因 ,并分析融合基因在活细胞中的表达。方法 应用基因工程技术构建H 2Kb 与绿色荧光蛋白 (GFP)的融合基因。RT PCR和Western印迹分析基因表达 ;激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。结果 RT PCR和Western印迹分析表明融合基因获得了正确表达。激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明 ,Kb GFP融合分子象天然Kb 分子一样表达在细胞膜表面 ,且胞外区域可被Kb 分子特异性单克隆抗体所识别 ,表明Kb GFP融合分子可在细胞内正确折叠和装配。Kb GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果。结论 Kb GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性 ,且不影响Kb 分子在细胞内的正确表达。

H-2K^b-BSP融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 构建可生物素化Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合基因的表达载体。方法 采用 ＰＣＲ技术，从 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋） Ｋ～ｂ中扩增出Ｈ－２Ｋ～ｂ基因的胞外区，拼接上依赖 ＢｉｒＡ酶的可生物素化序列后，克隆人ｐＥＴ－４２ｂ（＋）高效表达载体进行诱导表达。并对表达产物进行纯化与复性。结果 成功地构建了融合表达载体ｐＥＴ－Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ，对表达产物进行纯化与复性，并应用仅识别完整构象的抗Ｋ～ｂ分子的单克隆抗体对复性后产物进行了检测。证明表达产物已部分恢复了构象。结论 获得Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合蛋白的高效表达，为研究在原核系统中表达、纯化与复性，以及进一步利用亲和素在体外构建ＭＨＣ－Ｉ类分子四聚体，探讨免疫识别机制奠定了基础。

小鼠H-2K^b基因转染人肝癌细胞后激活免疫排斥反应的研究

目的：增强人肝癌细胞的免疫原性以激活宿主免疫细胞识别杀伤相应的肝癌细胞。方法：以脂质体介导小鼠Ｈ－２Ｋｂ基因转染肝癌细胞株，并检测Ｈ－２Ｋｂ抗原表达情况，然后用Ｈ－２Ｋｂ基因转染后的肝癌细胞体外激活效应细胞杀伤活性，再进行裸鼠动物实验。结果：Ｈ－２Ｋｂ基因转染人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２后，Ｓｏｕｔｈｅｍ印迹杂交结果显示，Ｈ－２Ｋｂ基因整合于肿瘤细胞染色体中，ＲＮＡ点杂交结果显示，Ｈ－２ＫｂＤＮＡ已转录成ｍＲＮＡ。免疫组化及流式细胞仪检测显示，Ｈ－２Ｋｂ抗原已在肝癌细胞胞膜上表达。转染后肝癌细胞在体外能强烈诱发效应细胞毒性，这种细胞毒性现象在裸鼠实验中得到进一步验证。结论：异源ＭＨＧ－Ｉ类基因Ｈ－２Ｋｂ转染肝癌细胞后可增强其免疫原性并激活免疫效应细胞杀伤活性。

H-2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的克隆H－2KbcDNA及研究其在多种真核细胞中的表达。方法RT－PCR法扩增H－2KbcDNA，克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN，PA317包装出重组病毒后，分别感染NIH3T3、COS7及MM45T．Li，PCR和RT－PCR分析目的基因表达，FACS分析H－2Kb在细胞膜上的表达。结果以双顺反子逆转录病毒载体pGCEN介导，分别建立了H－2Kb基因转导细胞：NIH3T3／Kb、COS7／Kb及MM45T．Li／Kb。PCR结果表明目的基因已存在于宿主细胞中，RT－PCR结果表明目的基因已获得正确表达。FACS结果表明H－2Kb分子已稳定表达在细胞膜表面。结论MHC分子基因在多种真核细胞中的表达为研究抗原递呈及抗肿瘤作用提供了基础。

脂质体介导mIL-12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠实验性肝癌的治疗作用

背景与目的:白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗。为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12(mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ(小鼠为H-2K)基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法:分别应用含mIL-12基因、C57BL/6小鼠H-2KbcDNA及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒载体pcDNA3,体外经新型脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导转染小鼠肝癌细胞株MM45T.Li,检测转染细胞外源基因的表达。将经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,注射于小鼠皮下,观察致瘤性的变化。在荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射上述脂质体-DNA复合物,观察瘤体生长情况及小鼠生存期的改变。结果:LF2000介导pcDNA3/GFP转染MM45T.Li细胞的最佳条件为脂质体与DNA为3∶1(μg∶μg),转染效率达30%。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,RT-PCR检测有mIL-12和H-2KbcDNA的特异扩增片段,WesternBlot检测显示有57kDaH-2Kb蛋白表达,ELISA检测mIL-12分泌量达48ng/ml/106细胞。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,其致瘤性下降;荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射该脂质体-DNA复合物,FACS检测显示小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+的数量治疗组较对照组高,?