可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体。方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-22b高效表达载体多克隆位点,诱导表达后对表达产物进行纯化,用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2Kd原核表达载体,测序证实H-2Kd-BSP融合基因序列正确。pET-H-2Kd原核表达载体可在大肠杆菌BL21中高效诱导表达H-2Kd-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的36%,主要以包涵体形式表达;经反复洗涤纯化,纯化蛋白纯度可达90%以上。纯化蛋白可被H-2Kd分子特异性单克隆抗体SF1-1.1所识别。结论可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2Kd-肽四聚体奠定了实验基础。

绿色荧光蛋白与H-2K^b融合基因的构建及表达

目的 构建GFP与H 2Kb 融合基因 ,并分析融合基因在活细胞中的表达。方法 应用基因工程技术构建H 2Kb 与绿色荧光蛋白 (GFP)的融合基因。RT PCR和Western印迹分析基因表达 ;激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。结果 RT PCR和Western印迹分析表明融合基因获得了正确表达。激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明 ,Kb GFP融合分子象天然Kb 分子一样表达在细胞膜表面 ,且胞外区域可被Kb 分子特异性单克隆抗体所识别 ,表明Kb GFP融合分子可在细胞内正确折叠和装配。Kb GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果。结论 Kb GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性 ,且不影响Kb 分子在细胞内的正确表达。