H-2K^d基因siRNA表达质粒的构建及在小鼠LAK细胞的表达

目的构建针对BALB/C小鼠H-2Kd基因siRNA表达质粒,观察其在小鼠LAK细胞的表达,为进一步研究H-2Kd基因功能奠定基础。方法设计siRNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,通过与线性化的pSi-lencer 3.0-H1连接,转化大肠杆菌DH5a扩增纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。采用siRNA表达质粒封闭小鼠LAK细胞MHC-I(H-2Kd)的表达,同时设空转染组和无关序列组,流式细胞术检测不同组别靶蛋白的表达。结果纯化的质粒分子量为2.8 Kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符,流式细胞术检测证实siRNA能够抑制靶蛋白的表达。结论成功构建了针对H-2Kd基因的siRNA表达质粒并抑制了其表达。

反义核酸封闭H-2K^d基因对鼠淋巴因子激活杀伤细胞活性的影响

目的 观察反义寡核苷酸封闭鼠淋巴细胞H-2Kd基因后,对其表达的影响及淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性改变,探讨淋巴细胞Ⅰ类主要组织相容性抗原(MHC-Ⅰ)在肿瘤免疫中的作用。方法 将人工合成的H-2Kd起始区反义寡核苷酸作用于小鼠脾LAK,流式细胞仪检测作用前后H-2Kd的表达率。噻唑蓝法检测H-2Kd表达降低的LAK对肿瘤杀伤活性。结果 反义寡核苷酸(15μmoL/l)组H-2Kd蛋白的表达率由90.1％±4.4％下降至79.8％±2.5％(P<0.01),H-2Kd降低的LAK杀伤活性明显降低,对K562的杀伤活性由82.3％±3.1％降到60.2％±6.7％(P<0.01),对H22细胞株的杀伤活性由67.4％±2.8％降到53.2％±8.1％(P<0.01)。结论 反义寡核苷酸能够抑制小鼠LAK表面H-2Kd的表达,但不影响LAK增殖活性,因而可导致鼠LAK对同种及异种肿瘤细胞的杀伤活性降低。