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人H-Ras12V突变蛋白表达载体的构建及表达
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作者 胡昳旸 梁亮 +2 位作者 尹郸丹 刘强 韩骅 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第24期2918-2920,共3页
目的:构建研究H-Ras12V突变蛋白的表达载体,并在体外进行表达和检测.方法:从细胞中分离提取RNA,通过RT-PCR扩增获得人的正常H-RascDNA,测序鉴定.通过PCR介导的定向突变的方法,在其第12位氨基酸处引入一个错义突变G→V,连入测序载体进行... 目的:构建研究H-Ras12V突变蛋白的表达载体,并在体外进行表达和检测.方法:从细胞中分离提取RNA,通过RT-PCR扩增获得人的正常H-RascDNA,测序鉴定.通过PCR介导的定向突变的方法,在其第12位氨基酸处引入一个错义突变G→V,连入测序载体进行鉴定.应用DNA重组技术,将获得的H-Ras12VcDNA插入真核表达载体pEGFP-C2,使用限制性酶切反应鉴定.通过脂质体将重组质粒转染入Hela细胞,使用Western Blot对其融合蛋白进行检测.结果:经过XhoI和BamHI的双酶切以及测序鉴定证实成功构建了pEGFP-H-Ras12V融合蛋白表达载体,克隆基因与GenBank登陆结果一致并成功实现其第12位氨基酸G→V的突变.WesternBlot证实融合蛋白特异性表达,并在转染的细胞系中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:成功构建了pEG-FP-H-Ras12V融合蛋白的表达载体,并在体外鉴定EGFP-H-Ras12V融合蛋白的表达. 展开更多
关键词 h-ras12v克隆 表达载体 融合蛋白
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H-ras12V促进肝肿瘤细胞脂肪变性机制探讨 被引量:2
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作者 李学凤 陈军 +3 位作者 赵文 王福金 王爱国 王靖宇 《中华肿瘤防治杂志》 CAS 北大核心 2015年第8期579-583,共5页
目的探讨固醇调节元件结合蛋白1c(transcription factor sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)在Ras癌基因诱导小鼠肝肿瘤细胞脂肪变性中的作用机制。方法采集9个月龄C57BL/6J小鼠(12只)正常肝组织(Wt)和H-ras12V转... 目的探讨固醇调节元件结合蛋白1c(transcription factor sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)在Ras癌基因诱导小鼠肝肿瘤细胞脂肪变性中的作用机制。方法采集9个月龄C57BL/6J小鼠(12只)正常肝组织(Wt)和H-ras12V转基因小鼠(12只)的肝肿瘤组织(T)及其周围组织(P),并用病理学方法进行确诊检测。酶偶联比色法检测组织样本中的甘油三酯含量,蛋白质印迹法检测磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶(phosphorylation ofphosphatidylinositol-3kinase,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B,p-AKT)及SREBP-1c的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测SREBP-1c靶基因乙酰辅酶A羧化酶a(acetyl-CoA carboxylase a,ACACa)、乙酰辅酶A羧化酶b(acetyl-CoA carboxylase b,ACACb)、硬脂酰辅酶A脱氢酶(stearoyl-CoA desaturase1,SCD1)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASn)基因的mRNA表达水平。结果正常肝组织和周围组织未发生组织病理学变化,肝肿瘤组织与周围组织边界清楚,肝肿瘤组织中的肿瘤细胞分化良好并伴有大泡性脂肪变性。与病理结果相一致,与正常肝组织(1±0.29)及转基因小鼠肝肿瘤周围组织(0.78±0.18)相比较,转基因小鼠肝肿瘤组织中的甘油三酯含量(2.14±0.15)显著增高,P值均<0.001,差异有统计学意义。转基因小鼠肿瘤周围组织与正常肝组织中的甘油三酯含量差异无统计学意义,P=0.092。蛋白质印迹法检测结果表明,与正常肝组织相比,p-PI3K在P和T中呈逐步升高趋势,且差异有统计学意义,P<0.05;与正常肝组织相比,p-AKT和AKT在周围组织和肝肿瘤组织中呈升高趋势,但仅肝肿瘤组织中的p-AKT差异有统计学意义,P=0.028;与正常肝组织及周围组织相比,肝肿瘤组织中的SREBP-1c前体蛋白及成熟体蛋白的表达水平均显著升高,P值均<0.001。实时荧光定量PCR检测结果显示,ACACb和SCD1在正常肝组织、周围组织及肝肿瘤组织中的表达呈逐步升高趋势,差异有统计学意义,P<0.05;与正常肝组织及周围组织相比,肝肿瘤组织中ACACa和FASn的mRNA表达水平显著升高,P<0.01,但它们在正常肝组织与周围组织中的表达差异无统计学意义。结论肝肿瘤Ras癌基因可能通过活化PI3K/AKT信号通路激活转录因子SREBP-1c,进而促进与脂质合成代谢相关靶基因的表达,增加肝肿瘤细胞的脂质沉积,诱导脂肪变性。 展开更多
关键词 h-ras12v 固醇调节元件结合蛋白 肝肿瘤细胞 脂肪变性
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低水平活性氧对Ras癌基因诱导肝肿瘤发生的影响 被引量:6
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作者 姚亮 李慧玲 +4 位作者 董建一 崔海鹏 王福金 王爱国 王靖宇 《中华肿瘤防治杂志》 CAS 北大核心 2015年第12期911-916,共6页
目的探讨活性氧(reactive oxygen species,ROS)在Ras癌基因诱导体内肝肿瘤发生中的作用。方法采用H-ras12V转基因肝癌小鼠模型,原位灌流法分离3个月龄雄鼠肝细胞和DCF-DA染色,流式细胞术检测肝细胞中的ROS水平;免疫荧光测定试剂盒检测7... 目的探讨活性氧(reactive oxygen species,ROS)在Ras癌基因诱导体内肝肿瘤发生中的作用。方法采用H-ras12V转基因肝癌小鼠模型,原位灌流法分离3个月龄雄鼠肝细胞和DCF-DA染色,流式细胞术检测肝细胞中的ROS水平;免疫荧光测定试剂盒检测7个月龄雄鼠肝组织ROS水平。对3和7个月龄雄鼠肝组织及肝肿瘤组织进行总蛋白提取,蛋白质印迹法检测ERK、p-ERK、p53、p21和Caspase-3的表达水平。结果流式细胞检测结果表明,3个月龄转基因雄鼠肝细胞中的ROS水平为7.81±0.53,比非转基因雄鼠肝细胞的1.00±0.16显著升高,t=21.31,P<0.001。免疫荧光检测表明,7个月龄转基因雄鼠肿瘤周围(P)组织中的ROS水平为18.25±4.41,比非转基因雄鼠肝(Wt)组织的2.42±0.61显著升高,t=6.16,P=0.004;比转基因雄鼠肿瘤(T)组织的3.18±1.75也显著升高,t=5.50,P=0.005。蛋白质印迹法检测表明,3个月龄转基因雄鼠肝组织中的p-ERK水平为5.36±0.32,比非转基因雄鼠肝组织的0.08±0.04显著升高,t=16.55,P=0.003。7个月龄转基因雄鼠肿瘤组织中p-ERK蛋白水平为22.09±6.57,比非转基因雄鼠肝组织的0.08±0.02显著升高,t=5.80,P=0.004;比转基因雄鼠肿瘤周围组织的8.60±3.23也显著升高,t=3.19,P=0.033;7个月龄转基因雄鼠肿瘤组织中p53蛋白水平为4.86±2.18,比非转基因雄鼠肝组织的39.23±13.43显著降低,t=-3.31,P=0.046;比转基因雄鼠肿瘤周围组织的31.09±7.60也显著降低,t=-3.32,P=0.029。7个月龄转基因雄鼠肿瘤组织中p21蛋白水平为4.38±3.28,比非转基因雄鼠肝组织的33.47±8.04显著降低,t=-5.95,P=0.010;比转基因雄鼠肿瘤周围组织的24.02±10.18也显著降低,t=-3.18,P=0.034。7个月龄转基因雄鼠肿瘤组织中的Caspase-3活化片段所占比例(17×103/35×103)为0.09±0.05,比非转基因雄鼠肝组织的0.22±0.04显著降低,t=-3.84,P=0.018;转基因雄鼠肿瘤周围组织的活化片段为0.10±0.05,比非转基因雄鼠肝组织的也显著降低,t=-3.68,P=0.021。结论在H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤周围组织中,Erk信号通路的激活,诱导了ROS水平的升高,进而抑制了肝细胞的癌变。而在肝肿瘤中,Ras癌基因通过某些机制诱导了ROS水平的降低及p53/p21及Caspase-3凋亡通路的下调,进而促进了肝肿瘤的发生发展。 展开更多
关键词 肝肿瘤 活性氧 h-ras12v 转基因小鼠
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