H1亚型禽流感病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用

以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间,利用侧向流动免疫(LFD)试纸条观测反应后的结果,最终建立检测H1亚型AIV的RT-RPA-LFD快速检测方法。结果表明:建立的RT-RPA-LFD快速检测方法在探针工作浓度为0.14 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(2)copies/反应的H1亚型AIV RNA,其他常见家禽病原体未见阳性反应。该方法与RT-PCR及鸡胚分离鉴定测序结果完全一致,可满足H1亚型AIV临床快速鉴别诊断的需求,为基层兽医现场快速检测提供技术支撑。

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白。通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础。

运用单克隆抗体分析流感病毒H1亚型HA蛋白的抗原表位

目的对甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白的抗原表位进行分析。方法以前期获得的97株抗H1亚型HA抗原的单克隆抗体为研究工具,用间接ELISA方法对不同亚型的血凝素抗原进行反应,将H1亚型HA蛋白的抗原表位进行粗分类,用ELISA阻断试验对抗原表位进行细分类。选取两类抗原表位的抗体,通过计算机模拟分析抗体与抗原结合的结构域,推测抗体结合的具体氨基酸位点。结果根据抗体的交叉反应性不同,将流感病毒H1亚型的HA的抗原表位分为8类;根据ELISA阻断试验的初步结果,H1亚型HA抗原的抗原表位又被细分为15类,通过计算机模拟分析预测的抗体与流感病毒HA抗原结合的氨基酸位点结果与ELISA阻断试验结果相吻合。结论证明流感病毒H1N1亚型HA抗原上至少含有15个抗原表位,且通过ELISA阻断试验和计算机模拟分析得到了相互印证,为流感病毒血凝素HA抗原表位预测方法的完善及通用疫苗的研制提供了实验数据。

H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。

H1亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种检测H1亚型禽流感病毒(AIV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据对GenBank中H1亚型AIV HA基因序列的分析,设计针对H1亚型AIV的HA基因特异性引物,并以H1亚型AIV的cDNA为模版,构建重组阳性质粒。采用梯度稀释重组标准品阳性质粒DNA的方法,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time PCR)标准曲线。敏感性试验结果显示,扩增效率和标准误差分别为100.9%和0.011 7,熔解曲线呈单一熔解峰。在35个Ct值内该方法可检测到100个拷贝的标准品DNA;特异性试验结果显示,该方法对于其他亚型AIV和禽呼吸道病原体不能检出;重复性试验结果显示,组内变异系数小于1%。建立的Real-time PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床上H1亚型AIV的检测。

H1亚型流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

目的:制备针对H1亚型流感病毒HA蛋白的单克隆抗体(mAb),并分析其反应特性。方法:分别以2009年甲型H1N1、季节性A1流感病毒裂解疫苗为免疫原,常规法免疫、融合、克隆化,获得各抗原特异性mAb。应用ELISA、HI试验和Western blot等技术研究mAb的反应性和特异性。结果:获得稳定分泌抗H1亚型流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞97株。其中株特异性mAb39株,29株具有HI活性;亚型特异性mAb7株,5株具有HI活性;2009年流行株与季节性A1、A3流行株共同抗原的mAb16株,9株具有HI活性;针对流感病毒共同抗原mAb35株,22株具有HI活性。结论:两种疫苗均具有较好的免疫原性和免疫保护活性,这些mAb的获得为流感病毒株特异、亚型特异性诊断试剂盒及流感病毒通用诊断试剂盒的制备提供了实验资料,为进一步研究H1N1流感病毒HA的抗原表位奠定了基础。

H1亚型流感病毒通用疫苗的构建及其对小鼠免疫保护效力研究

本研究旨在为研制一种安全、有效并具有广泛保护作用的流感病毒通用疫苗进行初步的探索。从Gen-Bank上获得所有H1亚型经典猪源流感病毒和甲型流感病毒的HA基因序列,通过系统进化分析获得其共有序列,并对共有序列进行密码子优化(Optimized consensus,opti-CS),同时将H1亚型的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和重组甲型流感病毒rPan09(H1N1,其HA和NA来自A/Swine/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因分别进行密码子优化(opti-G11,opti-r09),并将这3种片段与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒pCA-opti-CS、pCA-opti-G11和pCA-opti-r09。将重组质粒瞬时转染293T细胞,检测HA基因在哺乳动物细胞中的表达情况。免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔3周,同时设立空载体pCAGGS对照。三免2周后从每个质粒免疫组中选取一半小鼠每只以50μL 103.87 EID50的剂量接种A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)病毒,另一半小鼠每只以50μL 107.45 EID50的剂量接种rPan09病毒。采集血清,对HA抗体水平、HI滴度、细胞因子产生情况、肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果显示:重组质粒中HA基因均能够在哺乳动物细胞中有效的表达。pCA-opti-CS免疫后能够诱导小鼠产生较高的HA抗体水平,较高的HI滴度,并且能够诱导机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ。肺组织病毒含量测定以及组织病理学观察结果显示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS免疫后能够有效限制病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和rPan09HA在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。结果提示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并具有较好的交叉保护效力,能够保护小鼠抵抗异源流感病毒的攻击。本研究为流感通用疫苗的研究提供了有益的参考。

1株H1亚型水禽流感病毒分离株的致病特性和表面膜蛋白基因的序列分析

采用常规血清学试验和特异性RT-PCR方法,对我国华东地区家养水禽流感病毒进行了长达4年的跟踪监测,分离到多株H1亚型禽流感病毒,并对其中的1株A/Duck/Yangzhou/163/2003(简称Dk/YZ/163/03)的血凝素基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果发现,Dk/YZ/163/03的血凝素基因(HA)与禽流感日本分离株A/Japan/91(H1)的同源性最高;而神经氨酸酶基因(NA)与Mallard dk/A1b/35/1976(H1N1)同源性最高;其推导的氨基酸剪切位点序列为P-S-I-Q-S-R,是典型低致病性禽流感病毒的特征序列,这与该毒株对SPF鸡和BALB/c小鼠的低致病特性相吻合。

H1亚型猪流感病毒HA基因密码子优化的DNA疫苗免疫保护效力研究

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量及表达抗原的免疫原性有直接关系。为了提高猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）HA基因DNA疫苗的表达量，增强其免疫效果，本研究通过人工合成的方法将H1亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因密码子优化为猪体内偏嗜性密码子optiHA，同野生型A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因分别与真核表达载体PCAGGS连接构成重组质粒PCAGGS—optiHA和PCAGGS—HA，然后分别转染293T细胞，48h后采用间接免疫荧光的方法检测Ⅲ基因的瞬时表达蛋白情况。将质粒PCAGGS—HA、PCAGGS—optiHA以100μg／只的剂量，采用后腿肌肉多点注射的方式，免疫6-8周龄雌性BALB／c小鼠，同时设立空载体PCAGGS对照。共免疫3次，每次间隔2周，三免2周后对每组以10^3.87 EID50的A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）进行攻毒。采用ELISA、血凝抑制试验、细胞因子检测和肺组织病毒含量测定等实验评价这两种DNA疫苗的免疫效果。结果表明，HA基因密码子优化的DNA疫苗可显著提高体液免疫和细胞免疫的应答水平，攻毒后免疫组PCAGGS—optiHA的保护效力明显高于免疫组PCAGGS—HA。这一结果为进一步研究和设计有效的SIVDNA疫苗奠定了基础。

表达SIV H1亚型HA蛋白重组腺病毒的构建与生物学特性研究

本研究对猪流感病毒A/Swine/Guangdong/3/2003(H1N1)株(SIV-GD03株)的HA基因序列进行了遗传演化分析,结果表明SIV-GD03株与GenBank中登录的全部192株H1亚型SIV中的151株核苷酸序列相似性达到85%以上,表明该毒株具有作为疫苗候选株的分子特征。将SIV-GD03的HA基因克隆到腺病毒穿梭载体pAd-CMV5-IRES-GFP中,将得到的重组穿梭质粒pAd-H1-IRES-GFP电转化至BJ5183感受态细胞中,与人5型腺病毒骨架质粒同源重组获得重组腺病毒质粒prAd-H1-IRES-GFP,该质粒线性化后转染AD-293细胞。包装出的重组腺病毒rAd-H1HA-GFP通过荧光显微镜观察、PCR和western blot鉴定,证明HA基因和GFP基因在重组腺病毒中得到高效表达,该毒株在AD-293细胞上连续传12代后表现出较好的整合稳定性及传代稳定性。

整合H1亚型流感病毒血凝素蛋白伪型病毒的构建

为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorina/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒。通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程。本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具。

2014年-2015年粤北规模猪场H1亚型猪流感血清学调查与分析

为调查粤北地区规模化猪场H1亚型猪流感病毒的流行和感染情况,采用H1亚型猪流感抗体检测试剂盒检测2014年-2015年采自粤北25个未进行SIV免疫的规模化猪场的376份猪血清。结果表明,2014年和2015年H1亚型猪流感感染总抗体率分别为13.04%和14.58%,而1月~3月的感染抗体阳性率分别为19.05%和25.00%。该地区H1亚型猪流感感染抗体阳性率相对较低,表现出一定的区域性特征,1月~3月感染抗体阳性率均明显高于其他月份,该地区冬季抗体阳性率相对较高。

巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立

为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。

H1亚型禽流感病毒的分离鉴定

为了解广西H1亚型禽流感病毒(AIV)的分布情况及其致病性的特点,针对2011年至2012年广西自治区内活禽采集棉拭子样品进行H1亚型AIV的分离与初步鉴定,共分离纯化到6株H1亚型AIV。通过血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)发现分离株只与H1亚型AIV的血清反应,RT-PCR鉴定其在422bp处出现目的条带,进一步确定其为H1亚型AIV。再根据鉴定后的毒株对鸡胚半数感染量(EID50)、鸡胚半数致死量(ELD50)的测定与致病性试验,发现6株分离株均不会致SPF鸡死亡,确定所分离的H1亚型AIV为低致病性禽流感病毒。

具有HI活性的H1亚型流感病毒特异性单克隆抗体的制备与应用

为了制备具有HI活性的HI亚型流感病毒特异性单克隆抗体(MAb),本研究以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)株A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经常规细胞融合后,血凝抑制(HI)方法进行检测,融合细胞经稀释克隆纯化后,获得11株能稳定分泌抗血凝素特异性HI MAb的杂交瘤细胞株。鉴定表明,所获MAb与其他具有血凝活性的病毒以及其他14个HA亚型的流感病毒均不具有HI交叉反应,表明这11株MAb均具有良好的流感病毒亚型特异性。其中A6F、2BBF和2BB与其他H1亚型流感病毒分离株的HI试验证实我国不同地区分离株之间的抗原性存在一定差异。11株MAb对H1SIV抗原的HI试验结果显示其HI效价有明显差异。叠加实验表明这些MAb分别识别HA抗原的不同表位。间接免疫荧光试验表明,2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB均可与2009年流行H1N1病毒A/California/04/2009HA抗原发生特异性反应。这些MAb特异性的研制为H1亚型流感病毒的疫情病原学快速诊断以及病毒抗原性变异的相关研究提供了物质基础。

两株H1亚型猪流感病毒对猪的致病能力分析

为研究H1亚型猪流感病毒分离株A/Swine/Guangdong/SS1/2012(H1N1,SS1)和A/Swine/Guangdong/YJ28/2014(H1N2,YJ28)的致病力,本研究对2株病毒基因组进行分析,并将2株病毒分别通过滴鼻途径感染仔猪后观察临床症状,在攻毒后4 d与7 d迫杀实验猪采集脏器样品,检测脏器病毒滴度,进行肺病理切片观察和免疫组化实验,比较2株猪流感病毒对猪的致病能力和排毒情况。遗传进化结果显示,SS1分离株8个节段均属于欧亚类禽分支,YJ28为欧亚类禽、pdm/09和人季节性流感的新型重组病毒。动物实验结果显示,两株猪流感病毒均能够在猪只上复制,临床症状均不明显。鼻拭子排毒检测结果显示,YJ28组猪排毒仅持续至感染后第6 d,但SS1组猪在整个实验周期均能检测到排毒。实验猪脏器病毒检测和病理切片结果显示,SS1组相比于YJ28组脏器病毒滴度更高,且造成更严重的肺部病理损伤。本实验分离株SS1相比YJ28在PB2基因出现D^(701)N突变,这或许是SS1比YJ28具有更强致病能力和更长排毒周期的原因。本研究结果为H1N1和H1N2猪流感病毒对猪的致病能力和排毒情况提供实验依据。

H1亚型猪流感病毒微滴数字RT-PCR定量检测方法的建立

本研究针对H1亚型猪流感病毒(swineinfluenzavirus,SIV)HA基因保守序列设计引物和探针,通过反应条件优化,建立了一种快速、准确检测H1亚型SIV的微滴数字RT-PCR定量方法。该方法特异性强,除H1亚型SIV外,H3、H5、H7亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等检测均为阴性;敏感性高,最低可检测4.7拷贝/μL;重复性好,对5个不同稀释度的H1亚型SIVRNA进行3次重复试验,每个稀释度的变异系数均小于5%。利用该方法对湖南省规模化养殖场收集的30份猪鼻拭子样品进行检测,发现与荧光RT-PCR检测结果一致。试验表明,该方法快速、准确、灵敏,可为H1亚型SIV的快速筛查及流行病学研究提供可靠的技术保障。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

2022—2023年黔东南州猪流感病毒H1亚型血清学调查研究

猪流感H1亚型病毒是当前危害猪群及人类的重要病原,具有十分重要的公共卫生学意义。为掌握黔东南州猪流感H1亚型病毒流行情况,采集2022—2023年黔东南州猪血清样本1 656份,采用ELISA方法检测样本中H1亚型病毒感染抗体情况。结果显示,黔东南州各地存在H1亚型病毒不同程度的感染,总体阳性率为28.99%;以县市统计,施秉县阳性率最高,为73.53%,凯里市、天柱县、黎平县及从江县阳性率最低,均为0%;以养殖规模大小统计,规模养猪场阳性率最高,为37.84%,中小型养猪场次之,为28.10%,普通散养猪场阳性率最低,为0%;以不同季节采样统计,冬、春季节阳性率为33.33%,夏、秋季节阳性率为24.64%。结果表明,2022—2023年猪流感H1亚型病毒在黔东南州猪场存在不同程度感染情况,施秉县感染率最高,凯里市、天柱县、黎平县及从江县暂未发现感染;规模养猪场感染率明显高于中小型养猪场,散养户猪场暂未出现感染;冬、春季节阳性率高于夏、秋季节。

1株H1N1亚型猪流感病毒的进化分析及分子特征研究

【目的】鉴定贵州省猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行株及其分子生物学特征,为猪流感的病原学研究和流行病学调查提供重要参考。【方法】从贵州省部分养殖场采集猪鼻腔拭子70份,采用RT-PCR和接种犬肾上皮细胞(MDCK)对疑似猪流感的阳性样品进行病毒分离鉴定,对分离株进行克隆测序获得全基因组序列,运用生物信息学在线软件分析毒株的遗传重组情况和关键氨基酸分子特征。【结果】试验分离到1株H1N1亚型SIV,命名为A/swine/Guizhou/ZY/2022(H1N1)。经全基因组测序和遗传进化分析结果显示,该毒株属于G4型欧亚类禽H1N1 SIV。生物信息学在线预测发现,分离株的HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支,NS基因属于北美重组分支,其余基因片段属于2009年大流行H1N1分支。分离株的HA蛋白裂解位点为PSIQSR↓GL,存在4个潜在糖基化位点,其受体结合位点和抗原位点与欧亚类禽H1N1 SIV高度一致;NA蛋白结构完整,存在5个潜在糖基化位点;分离株PB2蛋白发生了Q ^(591) R、R ^(251 )K突变,PB1蛋白和M2蛋白分别发生了N^( 375) S、L^( 473 )V和S^( 31) N突变。【结论】从贵州省分离到1株三源重排H1N1亚型SIV,属于G4型欧亚类禽H1N1病毒,其与人源唾液酸α2,6-Gal受体的结合能力可能有所增强,提示需加强对猪流感的流行监测。