H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种特异、灵敏和快速的H11亚型禽流感病毒(AIV)RT-LAMP可视化检测方法。根据H11亚型AIV HA基因保守序列,设计6条特异性引物,优化反应条件,进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,该方法只能扩增H11亚型AIV,不与其他亚型AIV和禽病病原体发生交叉反应,表明该方法特异性强;对H11亚型AIV RNA的检测下限为10fg,表明该方法敏感性高;在63℃等温条件下作用1h即可完成全部扩增反应;对206份临床样品的检测结果与病毒分离一致。结果表明,本研究中建立的H11-RT-LAMP检测方法具有简便、快速和结果可视化的优点,尤其适合在基层兽医站和养殖场进行快速检测,具有非常广阔的应用前景。

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

区别clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

禽流感(Avian influneza,AI)是由正粘病毒科的禽流感病毒(AIV)引起的,疫苗接种策略是控制高致病性禽流感的有效手段,而疫苗接种策略成功的关键在于有与流行毒株相匹配的疫苗株。本试验根据clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素(HA)基因所存在的特征性核苷酸序列差异来设计1对引物,利用实时荧光定量PCR反应后生成熔解曲线的Tm值与其GC含量正相关的特点,通过观察实时荧光定量PCR扩增反应后熔解曲线Tm值差异,即可精确对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5AIV感染情况进行准确鉴别诊断,为H5 AIV疫苗使用提供科学数据。

灰树花多糖纳米乳的制备及其对H9亚型禽流感病毒与常见细菌抑制效果的评估

为制备灰树花多糖(GFP)纳米乳,并观察其理化及形态学特征,评估其对H9亚型禽流感病毒(AIV)及3种常见细菌的抑制效果,本研究采用低能乳化法制备GFP纳米乳,经不同方式处理后观察GFP纳米乳的稳定性,分别采用透射电镜和扫描电镜观察其形态特征,使用激光粒度仪测定GFP纳米乳的粒径与多分散系数(PDI),使用电位仪测定其Zeta电位。结果显示:该GFP纳米乳外观澄清、透明,8000 r/min离心20 min和室温静止7 d后不分层、不破乳,表明制备的GFP纳米乳性状稳定。电镜观察可见许多单一分布的均匀圆球,其周围包裹着网格状凝胶基质;GFP纳米乳的粒径为10 nm~100 nm,平均粒径24.12 nm,PDI为0.096,Zeta电位为-18.6±4.3 m V,表明GFP纳米乳稳定性较好。将不同浓度的GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂分别于MDCK细胞中与H9亚型AIV NJ02株作用,通过计算各药物对H9亚型AIV的抑制率比较GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制效果。将不同稀释度的GFP纳米乳、GFP溶液及免手洗凝胶和75%乙醇分别与AIV NJ02株作用后,采用荧光定量PCR(q PCR)检测H9亚型AIV基因的拷贝数,并计算各药物对H9亚型AIV的抑制率。采用药敏纸片法检测GFP纳米乳、GFP原液、免手洗凝胶对禽舍3种常见细菌的抑菌效果。对H9亚型AIV的抑制率检测结果显示,当浓度低于10μL/mL时,GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂对H9亚型AIV的抑制率均小于55%,效果不明显;当浓度大于40μL/mL时,GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率极显著高于同浓度的免手洗凝胶(P<0.01);当浓度为80μL/mL时,GFP纳米乳可以100%抑制病毒增殖,且对细胞无毒性。qPCR结果显示,10倍稀释的各药物对H9亚型AIV的抑制率均明显高于100倍稀释的各药物,且10倍稀释的GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率均极显著高于免手洗凝胶、GFP原液和75%乙醇(P<0.01)。纸片扩散法结果显示,GFP纳米乳对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较强,但总体GFP纳米乳的抑菌效果比免手洗凝胶稍差。上述结果表明,本研究制备的GFP纳米乳性状稳定,对体外培养的H9亚型AIV具有良好的抑制效果,对禽舍常见细菌具有一定的抑制效果,且安全无毒副作用,有望作为安全高效的纳米消毒剂用于畜禽和人类的消毒。本研究为开发新型抗病毒中草药纳米消毒剂奠定了实验基础。

H3亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

H3亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染宿主广泛,具备跨物种传播的能力,不但造成了家禽的发病,还导致了多起人感染病例,具有重要的公共卫生意义。因此,有必要建立一种快速灵敏的H3亚型AIV的检测方法。本研究参考了GenBank近年来公开的H3亚型AIV HA基因序列,在保守区域设计一对特异性引物和Taq Man探针。通过对反应条件的优化,分别以cRNA阳性标准品和病毒核酸标准品为模板绘制标准曲线,建立了针对H3亚型AIV的荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性进行评估。进一步使用实验室攻毒鸡组织样品和临床拭子样品对该方法进行了验证。结果表明,该方法特异性强,与其他亚型AIV和常见禽类病原体均无交叉反应;检测下限分别为1.0×10^(2) copies·μL^(-1)和10^(2) EID 50·0.1 mL^(-1),灵敏度与常规RT-PCR相比提高了10倍;组内和组间变异系数均小于1.5%,重复性较好。动物攻毒临床试验样品和临床拭子样品检测结果显示,该检测方法敏感性高于普通RT-PCR方法,与病毒分离鉴定结果一致,符合率为100%,可用于临床检测。综上,本研究建立的H3亚型AIV荧光定量RT-PCR检测方法具备特异、快速、灵敏等特点,为H3亚型AIV的快速诊断和监测及防控提供一定的技术支持。

表达2.3.4.4b分支H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟病毒的构建及其免疫保护效力的研究

近年来,2.3.4.4b分支H5亚型禽流感病毒(AIV)引起的禽流感疫情在全球多国暴发,切断水禽作为AIV传播媒介的途径对于禽流感的防控意义重大。为研制针对当前H5亚型AIV流行株和鸭瘟病毒(DEV)感染均具有免疫保护作用的疫苗,本研究经PCR扩增2.3.4.4b分支H5亚型AIV HA基因,按照文献方法构建以DEV疫苗株为载体,表达2.3.4.4b分支H5亚型AIV代表株A/whooper swan/Shanxi/4-1/2020(H5N8)HA基因的重组DEV,命名为rDEV-14株。将rDEV-14株在CEF中连续传代后,经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测,并检测各培养时间rDEV-14株的TCID_(50),分析其生长特性。结果显示,在10、15代rDEV-14的PCR产物中检测到HA基因,IFA和western blot检测结果显示HA基因可在rDEV-14株各代中稳定遗传和表达。生长曲线测定结果显示rDEV-14株在CEF中的生长曲线与亲本病毒DEV疫苗株趋势一致。以不同剂量rDEV-14株免疫4月龄SPF鸭14 d后,采用DEV强毒AV1221株攻毒,结果显示,各剂量rDEV-14株均可诱导SPF鸭对DEV感染的完全免疫保护。以不同剂量rDEV-14株免疫2周龄SPF鸭后,分别利用同源和2021年~2022年分离的H5亚型异源高致病性AIV(HPAIV)(H5N6及两株H5N1 AIV)攻毒后记录各组鸭发病和死亡情况、检测排毒情况和HI抗体,结果显示,10^(4)TCID_(50)和10~5TCID_(50)免疫组鸭在攻毒后两周内无发病、无死亡、不排毒,并可诱导鸭产生良好且持久的HI抗体。上述结果表明本研究制备的重组病毒r DEV-14可对DEV强毒、同源H5亚型AIV强毒以及2021年~2022年分离的H5N1和H5N6异源HPAIV攻毒鸭产生完全的免疫保护力。本研究为我国水禽禽流感和鸭瘟的防控提供了新的候选疫苗株。

一株H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株产生原因的分析

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究中,我们通过模拟H9N2禽流感免疫压力筛选出携带HA_(D201N)单点突变的逃逸株,但HA_(D201N)如何导致H9N2病毒逃逸株出现的原因尚不明确。为此,本研究利用8质粒反向遗传技术方法拯救出1株A/Chicken/Shanghai/1/2006(H9N2)(简称SH1)及其免疫逃逸株rSH1-HA_(D201N)。为了鉴定HA_(D201N)是否通过影响H9N2禽流感病毒复制能力而导致病毒发生免疫逃逸,用0.001 MOI的病毒接种MDCK并测定其生长曲线,结果表明HA_(D201N)点突变可显著降低rSH1病毒的复制能力,且病毒复制能力的变化不是rSH1病毒发生逃逸的主要原因。为了研究HA_(D201N)是否通过影响H9N2病毒抗原变异而产生病毒逃逸株,将原毒株与突变毒株加入佐剂后免疫鸡以制备多克隆抗体血清,利用交叉HI试验,计算R值并分析抗原变异,结果表明rSH1与rSH1-HA_(D201N)的R值为2,说明HA_(D201N)会导致rSH1发生显著的抗原变异,从而使病毒在免疫压力下逃逸。本研究为探索H9N2禽流感病毒抗原变异规律及其疫苗研发奠定了基础。

表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒构建及其免疫效果评估

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的二联疫苗候选株,试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统,以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体,构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的重组血清4型腺病毒;并通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、Westernblot试验以及SPF鸡保护性试验等方法,探究此重组病毒体外生物学特性并评估其为鸡提供的保护力。结果显示:研究成功构建能稳定表达H7N9禽流感亚型病毒HA蛋白的重组血清4型腺病毒,命名为FAdV4-H7;FAdV4-H7能在LMH细胞高效复制,并能在LMH细胞传代15次后仍能稳定表达HA蛋白;FAdV4-H7不仅高度致弱,而且能诱导机体产生高滴度针对H7N9亚型禽流感病毒HI抗体和FAdV-4的中和抗体,能为SPF鸡提供足够保护来抵抗致死性FAdV-4感染。研究表明,试验成功构建了重组病毒FAdV4-H7,为H7N9亚型禽流感病毒和FAdV-4的联防联控提供了二联苗候选疫苗株。

16株新型H3N3亚型禽流感病毒的遗传变异分析

为了解新出现的H3N3亚型禽流感病毒(AIV)的遗传变异特征,对2022—2023年分离鉴定的H3亚型AIV进行了全基因组测序分析,并对代表株进行了抗原差异分析。结果共分离鉴定出15株家禽源和1株野鸟源H3N3亚型AIV。全基因遗传演化分析结果显示,16株分离株均属于欧亚分支,其HA基因均源自H3N8亚型AIV,与人源H3N8亚型AIV的核苷酸相似性为97.3%~99.2%;NA基因均源自H10N3亚型AIV,与人源H10N3亚型毒株的核苷酸相似性为98.1%~98.4%;内部基因片段均来自H9N2亚型AIV。分离株HA基因裂解位点均符合低致病性AIV的分子特征。分离毒株存在多个能增强病毒对哺乳动物适应性及致病性的突变位点,如PB2蛋白的A588V和E627V突变、PB1蛋白的I368V和S375N突变等。抗原差异性分析结果表明,分离株与华东地区早期流行株的HI抗体滴度相差1 log2~3 log2。因此,本研究分离的16株H3N3亚型AIV均为三源重组病毒,由H9N2亚型AIV提供全部内部基因,毒株存在多个哺乳动物适应性及致病性增强的突变,并已传播给野禽。本研究揭示了新型H3N3亚型AIV的遗传特征、变异和多宿主分布情况,为禽流感的防控提供理论支持。

检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

为建立快速检测H6亚型禽流感病毒的血清学方法,试验利用前期制备的两株抗H6亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体,建立检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法,并进行特异性、灵敏度、稳定性试验以及对活禽市场采集的48份咽拭子样品的检测效果。结果显示:该ELISA方法只与H6亚型禽流感病毒反应,而与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H12等其他亚型禽流感病毒,血清4型禽腺病毒、血清8b型禽腺病毒、血清3型鸭腺病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、传染性法氏囊病病毒以及禽白血病病毒均无交叉反应;该ELSIA方法可检测2.32×10^(4)TCID50/mLH6亚型禽流感病毒,批间和批内重复试验变异系数均小于10%;该ELISA方法和RT-PCR方法对活禽市场采集的48份咽拭子样品检测结果一致,进一步检测攻毒鸡的咽拭子显示该方法可有效检测咽拭子中H6亚型禽流感病毒。研究表明,基于两株单克隆抗体建立的检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,适用于H6亚型禽流感病毒感染的临床检测。

H7亚型禽流感病毒荧光微球抗体检测方法的建立

为建立一种简便、快速、特异的H7亚型禽流感病毒抗体检测方法,将荧光微球偶联标记鼠抗鸡IgG,并将羊抗鼠IgG和重组H7亚型禽流感病毒HA蛋白分别作为质控线(C线)和检测线(T线),喷涂于硝酸纤维素膜上。采用单一变量分析法对反应体系进行了优化,随后对该方法的敏感性、特异性、重复性及符合率进行了评估。结果显示:本研究建立的H7亚型禽流感病毒荧光微球抗体检测方法比参照国标建立的血凝抑制试验灵敏度高2倍;特异性较好,对H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒等常见禽病病原阳性血清的检测结果均为阴性;重复性试验结果的变异系数为3.13%~8.46%,具有较好的重复性;本研究方法和血凝抑制试验血清抗体检测结果的总体符合率为95.67%,两种方法具有较高的一致性。结果表明,本研究建立的H7亚型禽流感病毒荧光微球抗体检测方法性能稳定、结果可靠,为H7亚型禽流感快速检测提供了新方法。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

一株H11N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解禽流感病毒在华东地区家禽体内的进化情况,作者对华东地区某活禽市场的家禽进行了禽流感病毒的流行病学监测,并分离鉴定出1株H11N2亚型禽流感病毒A/duck/Jiangxi/k0701/2009。对该株病毒全基因组的遗传进化分析表明A/duck/Jiangxi/k0701/2009的8个基因片段来源广泛,与亚洲及欧洲某些地区的毒株存在广泛的重组现象。其PB2基因和NS基因可能由A/mallard/Korea/GH170/2007(H7N7)提供,NA基因与高致病性禽流感病毒A/duck/Hebei/0710/2009(H5N2)的NA基因亲缘关系较近,而PB1、PA和NP基因则可能与A/Muscovy duck/Thailand/CU-LM1984/2009(H4N9)有共同来源。本研究结果提示该株病毒可能为1株多元重组病毒,且可能在高致病性禽流感病毒的进化中起了重要作用。

2011—2015年环洞庭湖区H3亚型禽流感病毒的分离鉴定与遗传演化

为了解环洞庭湖地区家禽H3亚型禽流感病毒的感染情况和进化规律,笔者对2011—2015年湖南省环洞庭湖地区的多个活禽市场与散养鸭场分离的31株H3亚型禽流感病毒进行基因测序和进化分析。结果表明:所有病毒的HA裂解位点不含连续的碱性氨基酸,为低致病性禽流感病毒的分子特征;各基因片段进化树显示部分病毒的PA与PB2基因与H5在相同分支,部分病毒的NP、PA、PB1与H7处于相同分支,表明H3可能与H5、H7亚型的禽流感病毒发生了复杂的基因交换;散养家禽分离的部分H3亚型禽流感病毒内部基因与越南、韩国等周边国家野鸟源的H3、H6、H7、H11等亚型同源性较高,可能有相同的进化来源。进一步将分离的病毒进行全基因比对,可划分出21种不同的病毒基因型。环洞庭湖地区H3亚型禽流感病毒基因来源复杂,表现出明显的遗传多样性。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

2株2023年禽源H7N9亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的遗传进化特点,探究我国H7N9亚型AIV的流行特征,试验对2023年采集自四川、河北两地活禽市场禽类咽拭子及泄殖腔拭子进行病原分离鉴定,并对分离株进行全基因组序列测定,进一步构建进化树并分析其遗传演化情况和分子特征。结果显示:共分离2株H7N9亚型AIV,其遗传距离较近,HA基因均属于YRD-B分支;2株AIV的HA蛋白裂解位点均含有连续碱性氨基酸,具有高致病性的分子特征;PB2、HA和NA蛋白均具有哺乳动物适应性突变,其中HA蛋白第226位受体结合位点均由谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L),使其能够识别人流感病毒唾液酸受体,并且HA蛋白A27S、I96V、V143T、A169T、I187V和D457N抗原位点发生突变;2株AIV虽均能与Re-4和H7N9rHN7903灭活疫苗免疫血清产生交叉血凝抑制反应,但HI抗体效价较低。研究表明,从活禽市场分离到2株H7N9亚型AIV,其对家禽具有高致病性,且抗原性发生变化。

6株H9N2亚型禽流感病毒分子特征及遗传演化分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的分子变化特征及其跨物种传播的可能性,对实验室保存的6株H9N2亚型AIV的8个基因片段进行了序列测定及遗传演化分析,并且对6株病毒与选取的代表毒株进行了HA和NA同源性及关键氨基酸位点分析。结果显示,分离的6株病毒均为欧亚系,其中3株为G57基因型;4株病毒的HA蛋白发生了Q226L突变,2株病毒的HA发生了A190V突变。HA和NA均有增加或缺失的潜在糖基化位点。6株病毒的NA茎部均有62~64位的缺失,红细胞结合位点431~433较为保守,而368和369位变化较大。综上,6株病毒为低致病性AIV,HA和NA均含有哺乳动物适应性突变,增大了其跨宿主传播的风险。研究结果为我国H9N2亚型AIV的进化提供了参考依据,为其综合防控提供了理论指导。

11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析

[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶（NA）基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。[结果]11株毒株的NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%~99.5%和86.9%~99.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63~65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39~40位点缺失了2个氨基酸。11株分离株除了69、146、200、234位点处潜在的N-糖基化位点比较保守以外,其余的糖基化位点都出现了变异情况。红细胞结合位点（HB）在431~433位点区域比较保守,但在366~373和399~404位点区域的氨基酸发生了明显的变异。抗原决定簇中部分氨基酸序列变异也较为活跃,推测与使用疫苗后的抗体选择有关。NA蛋白酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。[结论]江苏、安徽、浙江等省养殖鸡群中的H9N2亚型禽流感病毒仍以Y280-like分支较为常见,鸭群中出现G1-like分支应引起人们的注意。NA基因存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。

禽流感H11N9亚型病毒东方白鹳分离株的基因特征

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成12对特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别成功扩增出分离于东方白鹳(Ciconia boyciana)的1株H11N9亚型禽流感病毒的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树。结果表明:所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为2280、2274、2151、1692、1497、1413、759、838bp核苷酸,分别编码759、757、716、563、498、470、252/97、230/121个氨基酸。该毒株HA有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点序列为PAIASR↓GLFG,无连续的多个碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。根据该毒株与参考毒株的序列比较分析结果推测,该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过互相基因交换所形成的基因重组体。