miR-142-5p通过影响上皮间质转化抑制肺腺癌H1650细胞的侵袭与迁移

目的:探讨肺腺癌组织中miR-142-5p的表达及其对H1650细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelieal-mesenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。方法:收集2014年1月至2015年1月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切除并经病理证实的107例肺腺癌患者的癌组织及其癌旁组织标本,以及人肺腺癌细胞系H1650、HCC827、A549、H1975、PC9和人支气管上皮细胞BEAS-2B,用qPCR实验检测肺腺癌组织及细胞中miR-142-5p的表达水平及其与患者临床特征的关系。分别用miR-142-5p模拟物(mimics)、miR-阴性对照质粒(miR-NC)转染H1650细胞后,用CCK8、细胞划痕愈合和Transwell侵袭实验分别检测H1650细胞的增殖、侵袭和迁移能力。使用生物信息学工具预测miR-142-5p的靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p对靶基因的调控作用,Western blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)及EMT相关蛋白的表达水平。结果:肺腺癌组织及细胞系中miR-142-5p表达水平显著低于癌旁组织及BEAS-2B细胞(均P<0.01);107例肺腺癌组织中,61例(57.01%)低表达miR-142-5p,其表达水平与患者的TNM分期、淋巴结转移密切相关(均P<0.01)。转染miR-142-5p模拟物后,H1650细胞中miR-142-5p高表达,细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著降低(均P<0.05或P<0.01)。生物信息学工具预测CDK5是miR-142-5p的靶基因,经双荧光素酶报告基因验证,miR-142-5p可显著降低H1650细胞中CDK5的表达水平,显著提高E-cadherin表达,降低N-cadherin和Snail的表达水平(均P<0.01)。结论:miR-142-5p在肺腺癌组织和细胞中呈低表达状态,其通过下调CDK5表达影响EMT抑制H1650细胞的侵袭与迁移能力。

BRCA1通过Wnt/β-catenin通路对非小细胞肺癌H1650细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)通过Wnt/β-catenin通路对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)H1650细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用WB法和q PCR法检测NSCLC细胞系A549、H1299、H1650和正常肺上皮细胞BEAS-2B中BRCA1 m RNA和蛋白的表达水平。在H1650细胞中构建稳定BRCA1过表达细胞株(LV-BRCA1),实验分为空白对照组(NC)、阴性对照组(LV-BRCA1-NC)、实验组(LV-BRCA1)和抑制剂组(LV-BRCA1+XAV-939)。用MTT法、划痕愈合实验和Transwell小室法分别检测各组细胞的增殖、迁移和侵袭能力,WB法检测细胞中BRCA1、cyclin D1、β-catenin、c-Myc和Cox2蛋白的表达水平。结果:NSCLC细胞中BRCA1 m RNA和蛋白的表达水平均显著高于BEAS-2B细胞(均P<0.01)。上调BRCA1可显著提高H1650细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05或P<0.01),上调细胞中cyclin D1、β-catenin、c-Myc、Cox2和c-Jun蛋白的表达(P<0.05或P<0.01);XAV-939可显著下调过表达BRCA1细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05或P<0.01),并降低细胞中cyclin D1、β-catenin、c-Myc、Cox2和c-Jun蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:BRCA1通过激活Wnt/β-catenin通路促进NSCLC H1650细胞的增殖、迁移与侵袭,其有望成为NSCLC诊断标志物和治疗靶标。

阿帕替尼对肺腺癌H1650细胞增殖、活性氧水平和凋亡的影响

目的:研究阿帕替尼对肺腺癌H1650细胞增殖、活性氧(ROS)水平和凋亡的影响。方法:采用不同浓度(0. 000、0. 125、0. 250、0. 500、1. 000、2. 000、4. 000、8. 000、16. 000、32. 000、64. 000μmol/L)的阿帕替尼作用于肺腺癌H1650细胞72 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;平板克隆实验观察0(对照)、2、4、8μmol/L阿帕替尼作用9 d后H1650细胞的克隆形成率; 0(对照)、8、16、32μmol/L阿帕替尼处理后,在流式细胞仪上检测H1650细胞内的ROS水平和凋亡情况,采用Western blot方法检测H1650细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果:阿帕替尼作用后H1650细胞的增殖抑制率升高,组间两两比较,差异均有统计学意义(P <0. 05)。与对照组相比,阿帕替尼组H1650细胞克隆形成率降低,凋亡率、细胞内ROS水平、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P <0. 05)。结论:阿帕替尼可抑制H1650细胞增殖,增加细胞内ROS水平,促进凋亡。

NF-κB亚单位p50/p65激活促进肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药

目的探究NF-κB经典通路激活与人肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药的内在联系。方法选择肺腺癌HCC827和H1650亲代细胞株,吉非替尼连续处理60 d,检测细胞株生长情况和各细胞株595nm吸光度,确定各细胞株细胞存活率和H1650亲代细胞被诱导成H1650耐药细胞株。Western blot检测各细胞株P-IκBα、NF-κB P-p50和P-p65表达量,Image J灰度仪计算出胞浆和胞核P-p50和P-p65与内参蛋白灰度比值,比较吉非替尼和吉非替尼加吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)联合用药状态下,各细胞株细胞存活率和P-IκB、P-p50和P-p65的表达。结果在无吉非替尼和吉非替尼加PDTC药物干预下,H1650耐药细胞PIκBα表达增加,胞浆和胞核P-p50和P-p65表达,H1650耐药细胞株>H1650亲本细胞株>吉非替尼敏感HCC827细胞株(P<0.05,P<0.01);单独使用吉非替尼干预,H1650耐药细胞株细胞抑制率较H1650亲本细胞株和HCC827细胞株降低(P<0.05,P<0.01),H1650耐药细胞株P-p50和P-p65表达较其他两类细胞株升高(P<0.05);与无吉非替尼干预比较,H1650亲代和耐药细胞P-p50和P-p65均有显著降低(P<0.05,P<0.01);吉非替尼联合PDTC干预,显示H1650亲代和耐药细胞存活率、胞浆和胞核Pp50和P-p65表达均较吉非替尼组降低(P<0.01,P<0.01)。结论 NF-κB经典传导通路激活是H1650亲代细胞残存和转化为吉非替尼耐药细胞的主要因素之一,吉非替尼联合PDTC用药可抑制P-IκBα生成和P-p50、P-p65的激活,从而降低H1650残存细胞生存率和耐药细胞的产生。

新型CRM1抑制剂S109通过阻断核输出抑制非小细胞肺癌细胞增殖

目的:研究新型染色体区域稳定蛋白1(chromosome region maintenance 1,CRM1)抑制剂S109对非小细胞肺癌细胞增殖的影响及其机制。方法:S109作用于非小细胞肺癌细胞株H1975和H1650,以CCK-8法检测其对细胞生长的影响,以Ed U法检测细胞中对细胞增殖的影响,以集落形成实验检测对细胞克隆形成能力的影响,以流式细胞术检测其对细胞周期的影响,以免疫荧光法检测对核输出标志蛋白Ran BP1细胞内定位的影响,以Western blotting检测对细胞中CRM1和Cyclin D1蛋白表达的影响。结果:S109(0.04、0.2、1、5、25和50μmol/L)可以剂量依赖方式显著抑制非小细胞肺癌H1975和H1650细胞生长(IC50值分别为1.4和1.2μmol/L);2和4μmol/L的S109均可以显著抑制非小细胞肺癌增殖[(51.3±2.8)%、(23.2±2.1)%vs(100±1.2)%,P<0.01]和克隆形成[(43.6±3.2)%、(26.8±2.8)%vs(100±1.4)%,P<0.01],并使细胞阻滞在G1期(G1期细胞数量由50.5%增加至74.9%)。S109可以特异性抑制核质转运标志蛋白Ran BP1的核输出,并诱导CRM1蛋白降解。结论:S109通过特异性抑制CRM1功能阻断核输出,从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖并阻滞细胞周期。

黄腐酚诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的初步研究

目的探索黄腐酚对人非小细胞肺癌细胞株A549与H1650凋亡的影响。方法采用CCK-8法检测黄腐酚对A549与H1650细胞增殖的影响;流式细胞术分析黄腐酚对两种细胞凋亡的影响;Western Blot法检测两种细胞被不同浓度黄腐酚干预后细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xl、pro-caspase-3的表达。结果黄腐酚能有效抑制A549与H1650细胞的增殖,其抑制强度与浓度呈正相关,对H1650细胞有更好的抑制作用;两种细胞的凋亡率随黄腐酚浓度的增大而上升,5μmol·L-1诱发的凋亡率与同浓度顺铂无差异(P>0.05);两种细胞中凋亡相关蛋白的表达与黄腐酚浓度相关。结论黄腐酚可能通过调控Bcl-xl、Bax、Caspase-3及其相关基因使非小细胞肺癌细胞发生凋亡。

5-aza-CdR增强吉非替尼对人非小细胞肺癌细胞株H1650敏感性机制的研究

目的:探讨EGFR基因启动子甲基化水平与人非小细胞肺癌细胞株H1650对吉非替尼敏感性之间的关系。方法:5-aza-CdR和吉非替尼单独或联合用药作用于H1650细胞株后,应用甲基化特异性PCR法检测EGFR基因启动子区甲基化状态;CCK-8法检测细胞增殖率;流式细胞仪技术检测细胞凋亡率变化;蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测EGFR蛋白和mRNA的表达情况。结果:5-aza-CdR可去除H1650细胞EGFR基因启动子区甲基化;CCK-8法检测结果显示,H1650对吉非替尼的敏感性较差,5-aza-CdR去甲基化后联合运用吉非替尼处理72h,联合用药组IC50为(2.93±0.95)μmol/L,与吉非替尼组(14.53±1.13)μmol/L、5-aza-CdR组(4.91±1.42)μmol/L比较显著降低,P<0.05;流式细胞仪技术结果显示,联合用药组细胞凋亡率为(83.62±4.3)%,与吉非替尼组(20.29±2.9)%、5-aza-CdR组(25.73±7.5)%比较,差异有统计学意义,P<0.05;蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法结果显示,吉非替尼与5-aza-CdR联合用药干预72h后细胞EGFR蛋白和mRNA表达显著下降,与单药组相比,具有统计学意义,P<0.05。结论:EGFR基因启动子区甲基化可能是非小细胞肺癌细胞株H1650对吉非替尼获得性耐药的机制之一。