瑞马唑仑调节HIF-1α/BNIP3信号通路对OGD/R诱导神经细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨瑞马唑仑对OGD/R诱导的神经细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养小鼠海马神经元细胞(HT22)并进行神经细胞氧糖剥夺/再复氧(OGD/R),筛选实验用瑞马唑仑浓度;将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、瑞马唑仑组、2-ME2组、瑞马唑仑+2-ME2组;CCK8法检测5组HT22细胞活力;流式细胞术检测5组HT22细胞凋亡率;透射电子显微镜观察5组HT22细胞自噬小体的形成;Western blot检测5组HT22细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。结果确定实验用瑞马唑仑浓度为50μg/mL;与对照组比较,OGD/R组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与OGD/R组比较,瑞马唑仑组HT22细胞自噬小体增加,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05);2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05)。与瑞马唑仑组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞自噬小体数量减少,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与2-ME2组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05)。结论瑞马唑仑可通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路促进OGD/R诱导的神经细胞自噬,抑制细胞凋亡,从而减轻OGD/R诱导的神经细胞损伤。

麻杏石甘汤对咳嗽变异型哮喘大鼠IL-6/STAT3信号通路及TRPV1感受器的影响

【目的】探讨麻杏石甘汤对咳嗽变异型哮喘(CVA)大鼠的治疗作用及机制。【方法】将60只大鼠随机分为正常组,模型组,麻杏石甘汤低、高剂量组,麻杏石甘汤高剂量+信号转导和转录激活因子3(STAT3)激活剂Colivelin(Col)组,每组12只。除正常组外,其他各组大鼠采用腹腔注射卵清蛋白结合艾条熏蒸法构建CVA模型。对应治疗后,观察大鼠体征和咳嗽次数,肺功能仪检测气道阻力(RE),Diff-Quik染色计数嗜酸性粒细胞(EOS),苏木素-伊红(HE)染色法观察肺、支气管组织病理学特征,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测肺组织单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,Western Blot法检测肺组织白细胞介素6(IL-6)、STAT3、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)蛋白表达水平。【结果】与正常组比较,模型组大鼠出现明显哮喘症状,肺组织可见炎性细胞浸润严重,支气管上皮细胞坏死、纤毛粘连、黏液多,RE,EOS数目,MCP-1、TNF-α含量,以及IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠哮喘症状明显改善,肺及支气管损伤减轻,RE,EOS数目,MCP-1、TNF-α含量以及IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.05);与麻杏石甘汤高剂量组比较,麻杏石甘汤高剂量+Col组大鼠哮喘加重,肺及支气管损伤加重,RE,EOS数目,MCP-1、TNF-α含量以及IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达水平升高(P<0.05)。【结论】麻杏石甘汤可有效改善CVA大鼠症状,其机制与抑制IL-6/STAT3信号通路及TRPV1高表达有关。

IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显升高(P<0.05);但与IGF-1组比较,PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结论IGF-1促进C3H10T1/2细胞成骨分化,其作用机制可能与激活ERK信号通路和p38 MAPK信号通路有关。

组胺H 1受体激动剂通过Akt/NF-κB通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症反应

目的探讨组胺H 1受体(histamine H 1 receptor,H 1R)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的星形胶质细胞炎症反应的影响及其调控机制。方法采用LPS建立体外星形胶质细胞炎症模型,随机将大鼠原代星形胶质细胞分为对照组、LPS组、LPS+H 1R激动剂组(2-pyridylethlamine,Pyri)和H 1R激动剂组。对照组仅加入培养液,LPS+H 1R激动剂组提前在培养液中加入100μmol·L-1的Pyri,1 h后再加入终浓度为100μg·L-1的LPS。CCK-8法检测细胞活性;免疫荧光法检测活化标记物GFAP和H 1R的表达;倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞的形态变化;ELISA法检测细胞上清中炎症因子TNF-α和IL-6水平;Western blot检测p-Akt、Akt、p-NF-κB p65、NF-κB p65的蛋白表达。结果与对照组比较,LPS组星形胶质细胞分支和辐射状突起减少,GFAP表达增加,细胞表面H 1R表达下调,上清液中TNF-α和IL-6含量增加,Akt和NF-κB p65的磷酸化水平明显增加;与LPS组相比,LPS+H 1R激动剂组激活态星形胶质细胞减少,GFAP表达降低,培养基上清中TNF-α和IL-6的含量明显下降,Akt和NF-κB p65的磷酸化表达明显降低。结论H 1R激动剂能够抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化和炎症因子的表达,且Akt/NF-κB通路可能是H 1R参与星形胶质细胞免疫调节的重要途径。

基于生物信息学方法和动物实验方法获取多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的生物学功能和信号通路信息

目的基于生物信息学方法和动物实验方法获取多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的生物学功能和信号通路信息。方法1.提取冻存组织细胞核。2.构建cut&tag文库。3.分析生物信息:1)评估多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的测序数据;2)确定reads在基因组上的分布;3)分析单个样本富集区间信息;4)分析peak转录因子;5)分析与Peak关联基因的GO功能富集、KEGG通路富集情况;6)分析差异关联基因基本情况;7)分析差异关联基因的GO功能富集情况;8)分析差异关联基因的KEGG通路富集情况。结果1.提取冻存组织细胞核:在显微镜下观察到细胞核计数>100000,表示细胞核提取成功。2.测序文库构建后,用qubit软件检查测序文库,结果显示合格。3.生物信息分析结果:1)实验组与参考基因库之间的数据相似程度>98%(测序数据良好),可进行下一步检测;2)多房棘球蚴病组和健康小鼠组的reads在TSS明显起峰;3)通过单个样本的富集,筛选出显著性Peak;4)与peak关联的转录因子主要集中在zf-C2H2、Homeobox和BHLH等;5)与Peak关联基因的GO功能主要富集在细胞蛋白大分子定位、细胞发育调节、解剖结构形态调控等生物学过程,与peak关联基因的KEGG通路主要富集在MAPK、cGMP-PKG、Hippo等信号通路;6)多房棘球蚴病组与健康小鼠组的组蛋白H3K4ME1存在5547个差异关联基因,其中上调基因2556个、下调基因2929个;7)组蛋白H3K4ME1差异关联基因GO功能富集分析的生物过程主要有细胞投射组织的正向调节、GTPase的活性调节等,细胞组分主要有细胞投影膜、突触等,分子功能主要有肌动蛋白结合、细胞黏附分子结合等;8)组蛋白H3K4ME1差异关联基因KEGG通路富集分析主要分布在MAPK、Wnt、Rap1等信号通路上。结论获得了多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的生物学功能和信号通路信息。

低分子肝素钠联合醋酸地塞米松基于PAR-2/TRPV1信号通路治疗小鼠瘙痒模型的有效性

目的基于蛋白酶激活受体2(PAR-2)/瞬时感受器电位香草酸受体1(TRPV1)信号通路探讨低分子肝素钠联合醋酸地塞米松治疗小鼠瘙痒模型的有效性。方法选取6周龄C57小鼠48只,采用随机数字表法将其中24只制成干皮症(AEW)慢性瘙痒小鼠模型,剩余24只制成DNFB过敏性皮炎急性瘙痒小鼠模型。将AEW慢性瘙痒、DNFB过敏性皮炎急性瘙痒小鼠模型均按照随机数字表法分为模型对照组、地塞米松组、肝素组、联合用药组,每组6只。模型对照组仅在小鼠脱毛部位给予0.9%氯化钠溶液;地塞米松组在小鼠脱毛部位涂抹醋酸地塞米松乳膏;肝素组在小鼠脱毛部位涂抹低分子肝素钠软膏;联合用药组在小鼠脱毛部位涂抹醋酸地塞米松乳膏、低分子肝素钠软膏。各组小鼠均持续干预7 d。比较各组小鼠干预前、干预7 d后瘙痒次数及PAR-2、TRPV1蛋白表达量。结果在AEW慢性瘙痒、DNFB过敏性皮炎急性瘙痒小鼠模型中,干预7 d后,联合用药组、肝素组、地塞米松组小鼠瘙痒次数均少于模型对照组,且联合用药组小鼠瘙痒次数少于肝素组、地塞米松组(P<0.05)。干预7 d后,在AEW慢性瘙痒小鼠模型中,肝素组、联合用药组TRPV1蛋白表达量低于模型对照组,联合用药组低于地塞米松组、肝素组(P<0.05);地塞米松组、肝素组、联合用药组PAR-2蛋白表达量低于模型对照组,联合用药组低于地塞米松组、肝素组(P<0.05)。干预7 d后,在DNFB过敏性皮炎急性瘙痒小鼠模型中,肝素组、联合用药组TRPV1、PAR-2蛋白表达量低于模型对照组,联合用药组低于地塞米松组、肝素组(P<0.05)。结论低分子肝素钠软膏可通过阻断PAR-2/TRPV1信号通路改善瘙痒症状,将其与醋酸地塞米松联合治疗对该通路的抑制效果更加显著。

DOT1L介导Notch1信号通路对喉鳞状细胞癌上皮间质转化的机制

目的探讨类端粒沉默干扰体1(disruptor of telomeric silencing 1-like,DOT1L)介导Notch1信号通路对喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的作用机制。方法选择30例病理确诊LSCC患者的肿瘤组织和癌旁组织,免疫组织化学染色检测DOT1L及其催化产物H3K79me3的阳性表达率,qRT-PCR检测DOT1L和H3K79me3的mRNA相对表达量。选择人LSCC细胞系TU686分为空白对照组、过表达组和低表达组,培养48 h后MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测Notch1、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量。结果(1)与癌旁组织相比,肿瘤组织中DOT1L和H3K79me3阳性表达率[(41.5±8.9)%vs.(18.3±3.6)%,t=56.963,P<0.001;(40.5±7.7)%vs.(10.2±2.3)%,t=96.635,P<0.001]以及mRNA表达量[(0.69±0.13)vs.(0.13±0.09),t=102.302,P<0.001;(0.42±0.19)vs.(0.09±0.03),t=85.659,P<0.001]均显著增加,差异比较有统计学意义。(2)与空白对照组相比,过表达组细胞增殖率明显升高(t=45.628,P<0.001),凋亡率降低(t=40.125,P<0.001),Notch1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达升高,E-cadherin降低(t=22.524、30.263、45.629、27.859,P<0.001);低表达组细胞增殖率显著下降(t=33.427,P<0.001),凋亡率增加(t=78.529,P<0.001),Notch1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达下降,E-cadherin增加(t=19.864、23.524、28.957和33.426,P<0.001)。结论DOT1L在LSCC中高表达,影响组蛋白的甲基化水平,进而调控细胞增殖、凋亡和EMT行为,DOT1L有望成为肿瘤靶向干预的新位点。

沙棘花青素提取物对双氧水诱导的H1299细胞损伤的保护作用及Nrf2/HO-1通路的影响

目的:研究沙棘花青素提取物(The anthocyanidin extract of Hippophae rhamnoides L.,HRAE)对双氧水诱导H1299细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法:利用双氧水诱导H1299细胞氧化损伤模型,采用MTT法检测HRAE对细胞活力的影响,采用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量;采用试剂盒分别测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathion peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;采用Western Blot法检测血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶-1(NAD(P)H quinine oxidoreductase 1,NQO1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch like ECH-associated protein 1,Keap1)和核转录因子E2相关因子(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的蛋白质水平;采用相关数据库和软件对沙棘花青素提取物的关键活性成分表儿茶素和儿茶素与氧化应激关键靶点蛋白Nrf2进行分子对接验证。结果:MTT实验表明,在0~800μg/mL浓度范围内HRAE对细胞活力无显著性抑制作用(P>0.05);与模型组相比,给药组中MDA水平下降,SOD、CAT和GSH-Px等活性均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,给药组ROS的含量显著降低(P<0.05);Western Blot显示HRAE可显著(P<0.05)调节HO-1、NQO1、KEAP和Nrf2的蛋白质水平(P<0.05);分子对接结果表明表儿茶素和儿茶素与氧化应激关键蛋白Nrf2具有良好的自由结合活性。结论:沙棘花青素提取物以浓度依赖降低双氧水导致的H1299细胞氧化损伤,其机制可能与促进Nrf2/HO-1信号通路的激活有关。

丹参酮ⅡA通过miR-155-5p激活SIRT1-AMPK通路改善H9c2心肌细胞缺血/再灌注损伤

目的:探究丹参酮ⅡA(TⅡA)通过miR-155-5p激活沉默信息调节因子1(SIRT1)-腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路改善H9c2心肌细胞缺血/再灌注(I/R)损伤的机制。方法:体外培养H9c2细胞并建立I/R损伤模型,造模完成后将H9c2细胞随机分为模型组、TⅡA组、TⅡA+miR-NC组、TⅡA+miR-155-5p mimics组,转染后分别加入10μmol/L TⅡA进行干预,并以添加DMSO的H9c2细胞作为对照组。qRT-PCR检测miR-155-5p表达水平;MTT法分析细胞增殖能力;流式细胞术评估细胞凋亡情况;ELISA测定TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;Western blot检测SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白水平。结果:与对照组相比,模型组miR-155-5p表达升高,细胞活力下降,凋亡率及TNF-α、IL-17、LDH、MDA表达升高,IL-4、IL-10、SOD、SIRT1、p-AMPK表达减少(P<0.05);与模型组比较,TⅡA组miR-155-5p表达降低,细胞活力增强,凋亡率及TNF-α、IL-17、LDH、MDA表达下降,IL-4、IL-10、SOD、SIRT1、p-AMPK表达升高(P<0.05);与TⅡA组和TⅡA+miR-NC组比较,TⅡA+miR-155-5p mimics组miR-155-5p表达升高,细胞活力降低,凋亡率上升,TNF-α、IL-17、LDH、MDA表达上升,IL-4、IL-10、SOD、SIRT1、p-AMPK表达降低(P<0.05)。结论:TⅡA可通过下调miR-155-5p改善H9c2心肌细胞I/R损伤,其机制可能与激活SIRT1-AMPK通路有关。

基于CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路的黄芪-丹参配伍对缺氧/复氧诱导的H9C2细胞坏死性凋亡的影响

目的观察黄芪-丹参配伍对缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞坏死性凋亡的影响,基于CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路探讨其作用机制。方法体外培养H9C2细胞,建立缺氧/复氧模型。将细胞分为对照组、模型组、黄芪丹参+激活剂(油酸)组、黄芪丹参组和抑制剂(KN-93磷酸盐)组,分别于相应培养基培养。试剂盒检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)水平,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-qPCR和Western blot检测钙调蛋白激酶(CaMK)Ⅱδ、受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1、RIPK3、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,模型组细胞上清液LDH水平显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,黄芪丹参组细胞上清液LDH水平显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.01),CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。黄芪丹参作用与CaMKⅡδ抑制剂KN-93磷酸盐相当。结论黄芪-丹参配伍可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,抑制心肌细胞坏死性凋亡,其机制与下调CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路有关。

龙胆泻肝汤通过H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和P38MAPK通路干预湿疹大鼠的作用机制研究

目的 基于H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和P38MAPK通路探讨龙胆泻肝汤对湿疹大鼠的保护作用及相关机制。方法 60只大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、氯雷他定组(1 mg·kg^(-1))和龙胆泻肝汤低、中、高剂量组(6.3g·kg^(-1)、12.6g·kg^(-1)、25.2g·kg^(-1)),每组10只。除正常组外,其余各组大鼠采用二硝基氯苯(DNCB)建立湿疹模型,然后各组大鼠灌胃相应药物干预,1次/天,连续干预21天。末次给药后,测定大鼠耳肿胀度;采用苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠背部皮肤病理学变化;采用免疫组织化学法检测大鼠皮肤组织H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平;采用蛋白质印迹(WB)法检测大鼠皮肤组织P38MAPK、PP38MAPK蛋白水平。结果 与正常组比较,模型组大鼠耳肿胀度显著增加(P<0.05)且背部皮肤出现湿疹病理变化;皮肤组织中H1R、PAR-2、TRPV1水平与p-P38MAPK/P38MAPK比值显著升高(P<0.05);与模型组比较,氯雷他定组和龙胆泻肝汤低、中、高剂量组耳肿胀度显著减小(P<0.05)且病变程度减轻;皮肤组织中H1R、PAR-2、TRPV1水平与p-P38MAPK/P38MAPK比值显著降低(P<0.05)。结论 龙胆泻肝汤对湿疹大鼠具有保护作用,其机制可能与抑制H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和P38MAPK通路有关。

紫花牡荆素通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路抑制肝癌MHCC97H细胞的迁移和侵袭

目的用紫花牡荆素(casticin,CAS)处理MHCC97H细胞,观察其迁移和侵袭能力的变化,并初步探讨CAS的分子作用机制。方法CCK-8试剂盒检测不同浓度CAS对MHCC97H细胞活力的影响;分组开展细胞迁移和侵袭实验,评估MHCC97H细胞的迁移和侵袭能力;逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CAS处理后,MHCC97H细胞的miR-148a-3p和Wnt1 mRNA表达变化;迁移侵袭相关蛋白(MMP2、MMP9)和Wnt1蛋白表达量采用Western blot检测;Dual-Luciferase报告基因检测miR-148a-3p与Wnt13′-UTR的结合情况。结果CAS明显抑制MHCC97H细胞的生存活力,其对这种细胞的IC_(50)约为10.0μmol·L^(-1),亚细胞毒浓度的CAS(3.0μmol·L^(-1))可减弱这种细胞的迁移和侵袭能力;miR-148a-3p mimic或CAS均能抑制MHCC97H细胞迁移和侵袭能力,且两者联合处理后的抑制作用强于单独使用;过表达Wnt1能有效减弱CAS的抑制作用;CAS能明显上调MHCC97H细胞miR-148a-3p表达,同时Wnt1、MMP2和MMP9的表达呈现下降;Dual-Luciferase报告基因发现,miR-148a-3p可以直接靶向Wnt13′-UTR。结论CAS可通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路减弱肝癌细胞的迁移和侵袭。

基于TGF-β1/Smad3信号通路探讨lncRNA H19对慢性心力衰竭大鼠的影响

目的:基于转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad同源物3(Smad3)信号通路探讨长链非编码RNA H19(lncRNA H19)和微小RNA(miRNA)-200a对慢性心力衰竭大鼠心功能及心肌纤维化的影响。方法:选择清洁级成年健康雄性SD大鼠60只,采用随机数字表法分为假手术组和模型组,分别12、48只。采用结扎法构建心力衰竭模型大鼠,造模成功后,按随机数字表法分为心力衰竭组、lncRNA H19阴性对照组(阴性对照组)、lncRNA H19过表达组(过表达组)、lncRNA H19过表达+miRNA-200a过表达组(联合过表达组),每组12只。阴性对照组、过表达组和联合过表达组分别于第1、4、7、10、13、16天在大鼠尾部通过静脉注射lncRNA H19阴性对照质粒5 mL/(kg·d)、lncRNA H19质粒5 mL/(kg·d)、lncRNA H19质粒5 mL/(kg·d)和miR⁃NA-200a质粒2 mL/(kg·d);心力衰竭组、假手术组仅注射等剂量生理盐水,1次/d。末次注射2 d后,采用心脏彩色多普勒超声仪检测大鼠心功能指标[左心室心脏射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)];采用Masson染色法检测大鼠心肌纤维化情况,测定胶原容积分数(CVF);采用实时荧光定量PCR法检测大鼠心肌组织lncRNA H19、miRNA-200a转录水平;采用Western blot法检测大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,其余4组LVEDD、LVESD和TGF-β1、Smad3蛋白表达水平及miRNA-200a转录水平均明显升高,LVFS、LVEF和lncRNA H19转录水平均明显降低(P<0.05);与心力衰竭组、阴性对照组比较,过表达组和联合过表达组LVEDD、LVESD和TGF-β1、Smad3蛋白表达水平及miRNA-200a转录水平均明显降低,LVFS、LVEF和ln⁃cRNA H19转录水平均明显升高(P<0.05);与过表达组比较,联合过表达组LVEDD、LVESD和TGF-β1、Smad3蛋白表达水平及miRNA-200a转录水平均明显升高,LVFS、LVEF均明显降低(P<0.05),lncRNA H19转录水平差异无统计学意义(P>0.05)。假手术组大鼠心肌组织仅有少量胶原分布,组织细胞排列紧密无明显缝隙;与假手术组比较,心力衰竭组大鼠心肌组织出现大量增生的胶原,细胞排列不均匀,CVF明显升高(P<0.05);与心力衰竭组、阴性对照组比较,过表达组大鼠心肌组织胶原增生明显缓解,细胞整齐分布,CVF明显降低(P<0.05);与过表达组比较,联合过表达组大鼠心肌组织仍有大量胶原分布,细胞间隙扩大,CVF明显升高(P<0.05)。结论:lncRNA H19过表达可减轻心肌纤维化和心脏损伤程度,改善心功能,可能与调控TGF-β1/Smad3信号通路,抑制miRNA-200a表达有关。

基于H1R、PAR-2/TRPV1痒信号通路探讨马齿苋对急性湿疹的干预作用

目的:探讨马齿苋提取液对急性湿疹大鼠背部皮肤组胺受体1(H1R)、蛋白酶激活受体2(PAR-2)和瞬时感受器电位受体1(TRPV1)表达的影响及其对H1R、PAR-2/TRPV1信号通路的调控作用。方法:SD大鼠30只,分为正常组、模型组、马齿苋组,各组10只。采用二硝基氯苯(DNCB)建立急性湿疹模型,正常组除外。造模成功后,各组分别给予相应药物。末次给药后对各组大鼠进行湿疹面积及严重度指数(EASI)评分。免疫组化法检测H1R、PAR-2和TRPV1的表达,流式细胞技术测定细胞内钙离子(Ca^(2+))浓度。结果:与正常组比,模型组大鼠EASI(P<0.01)、H1R(P<0.05)和PAR-2(P<0.01)的含量、Ca^(2+)浓度(P<0.01)显著增加,TRPV1增加差异不明显(P>0.05)。与模型组比,马齿苋组大鼠EASI(P<0.01)、H1R(P<0.01)和PAR-2(P<0.01)的含量及Ca^(2+)浓度(P<0.05)显著减少,TRPV1减少差异不明显(P>0.05)。结论:马齿苋可减少H1R、PAR-2含量及降低Ca^(2+)浓度,发挥治疗急性湿疹的作用,其机制可能是通过降低上游分子H1R、PAR-2含量,使其下游分子TRPV1失活,减少Ca^(2+)内流,达到抗瘙痒的作用。

鳖甲煎丸经AT1R/VEGF信号通路对肝癌血管生成的影响

目的 探讨鳖甲煎丸通过AT1R/VEGF信号通路影响肝癌血管生成的相关机制。方法 将40只BALB/c小鼠分为正常组、模型组、阿霉素干预组(DOX组)及鳖甲煎丸干预组(BJJW组),每组各10只。除正常组外,余下3组小鼠均立肝癌HepG2移植瘤模型,造模期间各组给予生理盐水和相应的药物治疗(腹腔注射给药),连续治疗10 d。测量各组小鼠的瘤体体积和瘤体肿瘤,并计算抑瘤率;采用免疫组织化学法检测CD34的表达情况来反映肿瘤组织的微血管密度,并采用Wstern blot法检测各组小鼠肿瘤组织中血管生成相关蛋白——缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、金属基质蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9水平的表达情况,及血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)通路相关蛋白含量。结果 与正常对照组相比,模型组与各治疗组小鼠均形成瘤体组织,表示造模成功。其中模型组小鼠肿瘤体积、瘤体肿瘤[分别为(245.32±122.51)cm^(3)、(1.08±0.78)g]均明显大于治疗组[DOX组体积分别为(83.41±12.04)cm^(3)、(110.04±48.07)g;BJJW组分别为(110.04±48.07)cm^(3)、(0.63±0.34)g](P<0.05),肿瘤细胞凋亡率较DOX组和BJJW组明显偏低(P<0.05)。模型组MVD、CD34阳性表达率、VEGF、HIF-1α、MMP-2、MPP-9蛋白含量及AT1R通路相关蛋白含量均较正常对照组明显升高(P<0.05);而DOX组及BJJW组的MVD、CD34阳性表达率、VEGF、HIF-1α、MMP-2、MPP-9蛋白及AT1R通路相关蛋白含量均明显低于模型组(均P<0.05)。结论 鳖甲煎丸可通过抑制肝癌血管的生成来起到抑癌效果,这可能与AT1R/VEGF信号通路被抑制有关。

解表清里方干预甲型H1N1流行性感冒小鼠的抗病毒作用机制

目的:探讨解表清里方对甲型H1N1流行性感冒小鼠的抗病毒作用机制。方法:用随机数字法将36只7周龄雌性BalB/c小鼠随机分为空白组、模型组、西药组及解表清里方高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组6只。空白组给予等量生理盐水滴鼻,其余组小鼠给予甲型流感病毒液于左侧鼻孔滴鼻,每只50μL。造模2 h后,西药组给予0.037 5 g/(kg·d)磷酸奥司他韦灌胃;解表清里方高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予6.05 g/(kg·d)、3.02 g/(kg·d)、1.51 g/(kg·d)解表清里方灌胃。空白组及模型组同时给予生理盐水0.2 mL灌胃,均1次/d,连续5 d。对比各组肺指数、胸腺指数和脾脏指数,肺组织病理变化,肺组织中乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达,肺悬液中病毒基因及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)mRNA表达,肺组织中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达。结果:动物实验结果显示,与模型组相比,西药组和中药高剂量组能降低小鼠肺指数(P<0.05),其他组别能降低肺指数、升高胸腺指数和脾脏指数,但差异无统计学意义(P>0.05);解表清里方高、中剂量组能减轻小鼠肺部病变程度,西药组、解表清里方高、中剂量组能降低小鼠肺组织中M、NS2病毒基因复制水平(P<0.01或P<0.05);西药组和解表清里方高剂量组能降低小鼠肺组织中mTOR表达水平;西药组、解表清里方高剂量和中剂量组均能显著下调PI3K、AKT和GSK-3β蛋白和mRNA的表达水平(P<0.01或P<0.05)解表清里方低剂量组在各个方面与模型组相差不显著。结论:解表清里方甲型H1N1流感小鼠有抗病毒作用,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路中关键蛋白PI3K、AKT、GSK-3β、mTOR表达有关。

(R)-3-氨基-3,4-二氢-1-甲氧基喹啉-2(1H)-酮的合成

首先,以D-苯丙氨酸和二碳酸二叔丁酯为起始原料,经过Boc氨基保护合成N-叔丁氧羰基苯丙氨酸;然后N-叔丁氧羰基苯丙氨酸在甲氧氨盐酸盐的作用下生成缩合物2-(N-叔丁氧羰基)-N-甲氧基-3-苯丙酰胺;然后缩合物在催化剂二(三氟乙酸)碘苯的作用下成环生成3-(N-叔丁氧羰基)-3,4-二氢-1-甲氧基喹啉-2(1H)-酮;最后后者经过脱保护合成目标产物。该方法具有操作简单、成本低等优点,四步总收率15.1%,产物经过1H-NMR和MS确认。

东紫苏精油对间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的影响及机制

为探讨东紫苏精油对小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的作用及降脂机制,利用噻唑蓝[the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞成活率,以界定浓度的适宜范围;用油红O染色法对东紫苏精油作用后的细胞成脂分化作用进行分析;甘油磷酸氧化酶—过氧化物酶(glycerol phosphate oxidase-p-aminophenazone,GPO-PAP)法、胆固醇氧化酶、过氧化物酶和4-氨基安替比林苯酚(cholesterol oxidase,peroxidase and 4-aminoantipyrine phenol,COD-PAP)酶法检测东紫苏精油处理后细胞内甘油三酯、胆固醇含量的变化;荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹(western blot)分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxide proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinsα,C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein4,FABP4)mRNA和相关蛋白在成脂分化中的表达水平。结果表明:与空白对照组相比,高脂模型组的总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triacylglyceride,TG)含量显著增加(P<0.05),小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显增加。与高脂模型组相比,中剂量(50μg/mL)和高剂量(100μg/mL)精油组TC和TG含量明显下降,小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显下降。试验结果表明,东紫苏精油可能通过调控PPARγ/C/EBPα/FABP4信号通路发挥对C3H10T1/2细胞成脂分化的抑制作用,达到减脂目的。

TGFβR 1介导TGF-β/Smad信号通路对绵羊颗粒细胞功能的影响

旨在探究TGFβR1介导TGF-β/Smad信号通路调控绵羊颗粒细胞功能的机制。本试验收集绵羊卵巢颗粒细胞,通过构建pcDNA3.1(+)-TGFβR1和pcDNA3.1(+)-SMAD4过表达质粒载体及shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4干扰表达质粒载体,对绵羊颗粒细胞中TGFβR1和SMAD4基因分别进行过表达和干扰,利用CCK-8细胞增殖检测、流式细胞术、Annexin-V FITC/PI双染技术检测绵羊颗粒细胞增殖、细胞周期及凋亡功能,并结合Real-Time PCR及Western blot检测TGFβR1、SMAD4的mRNA水平和细胞凋亡相关蛋白BAX、BCL2、Caspase3的表达水平及TGF-β/Smad信号通路中TGFβR1、TGFβR2、SMAD2/3的磷酸化水平。结果显示,过表达TGFβR1和SMAD4均极显著促进颗粒细胞从G0/G1期进入S期的能力(P<0.01)、颗粒细胞增殖及抗凋亡蛋白BCL2的表达(P<0.01),抑制凋亡蛋白BAX和Caspase3表达(P<0.01)。干扰TGFβR1和SMAD4均极显著促进颗粒细胞凋亡及凋亡蛋白BAX和Caspase3的表达(P<0.01),抑制抗凋亡蛋白BCL2的表达(P<0.01)。进一步研究发现,过表达TGFβR1可促进TGF-β/Smad信号通路中TGFβR1、TGFβR2及SMAD2/3磷酸化水平(P<0.01),并极显著促进SMAD4的蛋白表达水平(P<0.01);干扰TGFβR1则显著抑制TGFβR1、TGFβR2(P<0.01)及SMAD2/3的磷酸化水平(P<0.05),并抑制SMAD4的蛋白表达(P<0.01);过表达SMAD4则会显著促进TGFβR1蛋白的表达(P<0.01)。研究表明,TGFβR1促进绵羊颗粒细胞的增殖及周期进程,抑制颗粒细胞凋亡,通过介导TGF-β/Smad信号通路中SMAD2/3及SMAD4的表达正向调控绵羊颗粒细胞的增殖与周期,并负向调控其凋亡。

大鼠背根神经节细胞中TRPV1与cAMP/PKA通路调控机制研究

目的探讨大鼠背根神经节细胞中,辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)与体内cAMP/PKA信号通路的调控作用。方法分离培养大鼠背根神经节原代细胞,分别应用cAMP/PKA信号通路的激动剂8-Br-cAMP和抑制剂H-89,TRPV1的激动剂辣椒素(capsaicin)、抑制剂i RTX进行干预,应用定量PCR和Western blot检测各组细胞的TRPV1、p-PKA的基因和蛋白表达,探讨TRPV1与体内cAMP/PKA信号通路之间的调控机制。结果与空白对照组比较,8-Br-cAMP组、capsaicin组TRPV1的基因及蛋白表达均明显增强,iRTX组TRPV1的基因及蛋白表达明显降低,H-89组TRPV1基因、蛋白的表达无明显变化;8-Br-cAMP组p-PKA的基因及蛋白表达明显增强,H-89组p-PKA的基因及蛋白表达明显降低,而capsaicin组、iRTX组p-PKA基因、蛋白的表达无明显变化。结论 cAMP-PKA信号通路是调控TRPV1表达的重要作用机制之一,同时可能存在其他信号通路对TRPV1也有一定调控作用。