应用荧光探针H_2DCF-DA检测光照致细胞内活性氧产生的初步研究

目的应用荧光显微镜及新型荧光探针H2DCF-DA检测在光源照射过程中人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)内活性氧的产生情况。方法将ECV304细胞接种于35mm培养皿中,24h后加入H2DCF-DA,使其终浓度为10μmol/L,孵育30min。利用荧光显微镜的激发光源作为照射光源,在采集荧光图像的同时完成光源照射,光源输出波长范围为460～490nm,功率密度约为100mW/cm2。连续采集DCF的荧光图,观察细胞内DCF荧光的变化情况,采用计算机图像处理和分析技术,求得细胞内不同照射时间点DCF平均荧光强度,进而得到平均荧光强度-时间曲线。另外,使用线粒体特异标记探针MitoFluorRed589与H2DCF-DA共同孵育细胞,分别采集同一细胞的DCF的荧光图和MitoFluorRed589的荧光图,并利用像素-荧光强度分析方法来确定DCF荧光在细胞内的分布位置。结果在光源照射的开始阶段,ECV304细胞内的DCF荧光强度迅速增加,在第10s时便上升至第2s时的2.2倍,但是随着照射时间逐渐延长,荧光强度增幅逐渐变小,到第60s时上升至第2s时的4.7倍。观察时间进一步延长,DCF的荧光强度的变化似乎进入平台期,继而开始出现下降。考察DCF荧光在ECV304细胞内的分布位置主要通过比较细胞内不同区域的I1/I2值,通过图像分析与计算得到线粒体区。

两种荧光图像采集设备在采集快速变化荧光图像方面的初步比较

目的通过对激光扫描共聚焦显微镜和CCD荧光显微镜采集的DCF探针荧光图像质量的比较,选择适合于快速变化荧光的图像采集设备。方法应用荧光探针H2DCF-DA孵育ECV304细胞后(孵育浓度为10μmol/L,孵育时间30min),分别利用激光扫描共聚焦显微镜和CCD荧光显微镜采集DCF荧光图像,并比较两者的成像质量。结果随着光照致活性氧的产生,DCF荧光的变化速度较快。激光扫描共聚焦显微镜采集的荧光图像表现为细胞内整体的DCF荧光强度增高,图像对比度稍差;而CCD荧光显微镜清晰地呈现细胞内的细节信息,准确地反映了细胞内DCF早期的分布位置。结论在采集快速变化的荧光图像时,CCD荧光显微镜系统优于激光扫描共聚焦显微镜系统。