非洲猪瘟病毒衣壳五邻体顶点蛋白(H240R)原核表达及免疫原性研究

【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。

非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定

为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价均高于1∶40000;亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体(12D6、21G3、8G7)重链亚类为IgG2b,13D2重链亚类为IgG1,轻链亚类均为k。Western blot和Dot blot鉴定结果表明,21G3、13D2株单克隆抗体识别的抗原表位为线性表位,而12D6和8G7识别的是构象表位。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,4株单克隆抗体均能特异性识别HEK293T细胞中表达的H240R蛋白。制备了ASFV H240R蛋白单克隆抗体,为H240R蛋白的表位和功能研究奠定了基础。

非洲猪瘟病毒H240R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的急性、高热、严重出血、致死率极高的动物传染病,给我国养殖业造成严重的经济损失。本研究将非洲猪瘟病毒H240R基因克隆至pET-28a(+)载体中,成功构建了pET-28a(+)-H240R原核表达载体,将重组载体转化入BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,成功获得了H240R重组蛋白,将其纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,分离血清并分析其反应特异性。ELISA检测结果显示,血清抗体效价达到1∶256000。Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明,制备的兔源多克隆抗体能够同时与原核和真核表达的H240R蛋白反应。本研究成功制备针对ASFV H240R蛋白的多克隆抗体,该多克隆抗体具有良好的反应活性及特异性,为建立针对ASFV抗原、抗体的免疫学检测方法提供了新的思路。