Na^(+)/Ca^(2+)交换体抑制剂SN-6和维拉帕米降低肾上腺皮质癌细胞系NCI-H295R醛固酮合成酶表达

目的研究Na^(+)/Ca^(2+)交换体(NCX)抑制剂SN-6和钙通道阻滞剂(CCB)维拉帕米对钾离子(K^(+))刺激的肾上腺皮质癌细胞系NCI-H295R(H295R)醛固酮合成酶表达的影响。方法H295R细胞分为对照组、K^(+)(15 mmol/L)处理组、钙通道阻滞剂维拉帕米(verapamil)(10μmol/L)处理组、SN-6(10μmol/L)处理组、K^(+)+维拉帕米处理组、K^(+)+SN-6处理组、维拉帕米+SN-6处理组和K^(+)+维拉帕米+SN-6处理组,用实时荧光定量PCR检测醛固酮合成酶(CYP11B2)的mRNA表达,用FLIPR Calcium6检测细胞内钙离子水平。结果与对照组相比,K^(+)刺激醛固酮合成酶CYP11B2的mRNA表达(P<0.001);SN-6和维拉帕米均抑制K^(+)刺激的CYP11B2的mRNA表达(P<0.01);与K^(+)+SN-6组相比,K^(+)+SN-6+维拉帕米组更能显著抑制CYP11B2的mRNA表达(P<0.001)。SN-6和维拉帕米显著降低K^(+)刺激的细胞内钙离子水平(P<0.0001)。结论SN-6和维拉帕米均抑制K^(+)诱导的H295R细胞的醛固酮合成酶的表达;SN-6联合维拉帕米处理,抑制作用更显著。

辛伐他汀对血管紧张素Ⅱ刺激的肾上腺皮质癌H295R细胞的分泌和增殖的影响

目的研究辛伐他汀对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的肾上腺皮质癌H295R细胞的分泌和增殖的影响。方法H295R细胞分为对照组、AngⅡ(100 nmol/L)处理组、辛伐他汀(10μmol/L)处理组和AngⅡ+辛伐他汀处理组,用化学发光法检测培养液中的皮质醇;用放射免疫分析法(RIA)检测培养液中的醛固酮;用实时荧光定量PCR检测11β-羟化酶(CYP11B1)和醛固酮合成酶(CYP11B2)的mRNA表达;用MTS法观察细胞增殖。结果与对照组相比,AngⅡ刺激皮质醇和醛固酮分泌及其合成酶CYP11B1与CYP11B2 mRNA的表达,辛伐他汀抑制皮质醇分泌及其合成酶CYP11B1 mRNA的表达(P<0.05);与单独AngⅡ处理组相比,AngⅡ+辛伐他汀组能显著抑制AngⅡ刺激的皮质醇和醛固酮分泌及其合成酶CYP11B1与CYP11B2 mRNA的表达(P<0.05);AngⅡ对H295R细胞增殖无明显影响,辛伐他汀抑制细胞增殖,并且,辛伐他汀与AngⅡ联合处理细胞,这种抑制作用更显著(P<0.05)。结论辛伐他汀抑制AngⅡ诱导的肾上腺皮质癌H295R细胞的皮质醇与醛固酮的分泌;辛伐他汀抑制H295R细胞增殖,与AngⅡ联合处理细胞这种抑制作用更显著。

慢病毒介导ACTHR过表达对人肾上腺皮质癌H295R细胞的增殖影响

目的研究ACTHR高表达对人肾上腺皮质癌H295R细胞的影响,并探讨ACTHR在肾上腺肿瘤发病中的作用。方法用慢病毒包装的ACTHR高表达载体感染H295R细胞作为实验组,同时设立对照组。用WST-1法及细胞计数法检测感染后细胞的增殖情况,感染48h后TUNEL法检测细胞的凋亡情况。结果 WST-1增殖检测发现实验组细胞增殖活性呈双重变化趋势,在前3天内增殖活性高于对照组细胞,尤其是第2天达到顶峰,但第4天后增殖活性低于对照组细胞;细胞计数法显示在增殖活性最高时,实验组和对照组细胞分别为(5.3±0.21)×103和(3.8±0.24)×103个,两组细胞计数结果对比具有统计学意义(P<0.05);而TUNEL结果显示荧光镜下两组细胞的凋亡情况无明显差异(P>0.05)。结论 ACTHR对肾上腺肿瘤的影响具有时间依赖性,但可能主要以促进细胞增殖为主,而对凋亡影响不明显。

EGF和AngⅡ激活人肾上腺皮质癌H295R细胞ERK通路

目的研究表皮生长因子(EGF)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合作用对肾上腺皮质癌H295R细胞的细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路的影响。方法用不同剂量的EGF和AngⅡ刺激H295R细胞,或用特异性EGF受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478预处理后再加入AngⅡ刺激细胞,用Western blot法检测磷酸化ERK1/2;EGF及AngⅡ单独或联合刺激细胞,检测ERK1/2、P90RSK和Bad的磷酸化水平。结果 EGF和AngⅡ均刺激细胞ERK1/2和P90RSK磷酸化,在刺激ERK1/2磷酸化上呈剂量依赖性,两者联合处理其激活ERK1/2和P90RSK的作用产生叠加,AngⅡ和EGF单独及联合处理细胞,ERK1/2磷酸化水平分别是对照组的6.3±1.4、2.2±0.6及10.1±1.1倍。AngⅡ刺激细胞Bad磷酸化,而EGF无此作用。AG1478不能阻断AngⅡ诱导的Erk1/2激活。结论EGF和AngⅡ明显激活H295R细胞的ERK信号通路,两者作用有叠加效应。

成纤维细胞生长因子2激活肾上腺皮质癌H295R细胞的ERK、AKT信号通路

目的成纤维细胞生长因子2(FGF2)刺激肾上腺皮质细胞生长,参与该部位肿瘤的发生,但其涉及的细胞内信号传导通路研究尚少。本文拟探讨FGF2对人肾上腺皮质癌H295R细胞ERK和AKT信号通路的影响。方法培养H295R细胞;FGF2刺激细胞不同时间,用Western blot检测ERK1/2、p90RSK、Bad和AKT的磷酸化水平;FGF2和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)共处理细胞,Western blot检测磷酸化ERK1/2和AKT。结果 FGF2作用5 min时磷酸化ERK1/2和p90RSK明显增加,10～20 min达峰;而10～20 min时磷酸化Bad稍增加;FGF2作用5 min激活AKT(Thr308)和AKT(Ser473),并持续至60 min。AngⅡ刺激5 min磷酸化ERK1/2达高峰,此后作用减弱;FGF2和AngⅡ共处理细胞产生协同激活ERK1/2的作用。结论 FGF2明显激活H295R细胞的ERK及AKT信号通路,并在激活ERK通路上与AngⅡ有协同作用。

DEHP和MEHP对H295R细胞类固醇激素合成基因表达的影响

为探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)及其代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯(mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)对H295R细胞类固醇激素合成关键基因表达的影响,本实验将H295R细胞分别暴露于DEHP(0、1、10、100、1 000μmol·L-1)和MEHP(0、1、10、100、1 000μmol·L-1)24 h,用MTT法检测细胞活性,并应用荧光定量PCR法分析细胞类固醇激素合成过程中关键酶的基因表达水平。结果显示,1 000μmol·L-1DEHP和MEHP对H295R细胞染毒24 h显著降低H295R细胞活力,所以本研究采用了较低的染毒浓度(0、1、10和100μmol·L-1)对H295R细胞染毒24 h来评估DEHP和MEHP对H295R细胞类固醇激素合成通路的影响。1、10和100μmol·L-1DEHP显著增加醛固酮合成酶CYP11B2的基因表达水平。10μmol·L-1DEHP显著上调了3-β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD2)的基因表达水平。1、10和100μmol·L-1MEHP显著下调了3-β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD1和3β-HSD2)、17β羟基类固醇脱氢酶17β-HSD4、17α羟化酶/17,20裂解酶CYP17和芳香酶CYP19a的基因表达水平。10和100μmol·L-1MEHP染毒H295R 24 h显著下调了CYP21和STAR的基因表达水平,然而,10和100μmol·L-1MEHP显著上调了CYP11B2的基因表达水平。100μmol·L-1MEHP显著下调了17β-HSD1的基因表达水平。上述研究结果表明,DEHP、MEHP都可不同程度影响H295R细胞类固醇激素合成过程中关键基因的表达。MEHP可以通过抑制STAR基因的表达,从而将影响胆固醇在细胞内的转运;并能显著性抑制类固醇激素合成过程中CYP17、CYP19a、3β-HSD1、3β-HSD2、17β-HSD1、17β-HSD4、CYP21基因的表达,最终将抑制H295R细胞中类固醇激素的合成。与DEHP相比,MEHP对H295R细胞类固醇激素合成关键基因表达的影响较明显。

补骨脂酚对人肾上腺皮质癌H295R细胞中睾酮和雌二醇分泌的影响

[目的]研究补骨脂酚对人肾上腺皮质细胞(H295R)睾酮及雌二醇分泌的影响。[方法]实验分为空白对照组及补骨脂酚不同浓度组,分别使用CCK-8法及酶联免疫吸附法(ELISA法)检测补骨脂酚对H295R细胞活力、睾酮和雌二醇分泌的影响;同时采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测补骨脂酚对睾酮和雌二醇合成酶CYP17A1和CYP19A1 m RNA表达的影响。[结果]补骨脂酚对睾酮合成酶CYP17A1 m RNA无显著影响,但能上调雌二醇合成酶CYP19A1 m RNA含量,具有减少睾酮分泌增加雌二醇分泌的作用。[结论]补骨脂酚促进H295R细胞中雌激素的产生。

H295R细胞系类固醇生成试验的研究进展

2011年新修订的经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南中增添了指南456——H295R细胞系类固醇生成试验,用来筛选和检测潜在的内分泌干扰物。H295R细胞能表达类固醇激素生成过程中涉及的所有酶类,已作为有效的体外筛选环境类固醇激素干扰物的模型,也可作为研究肾上腺皮质分化及其类固醇激素的分泌与调控以及雄激素产生的调节作用的模型。H295R试验已用于美国内分泌干扰物筛选项目(EDSP)的一级筛选,还发展了高通量H295R细胞系类固醇生成试验方法。本文主要就H295R细胞系的建立,在环境类固醇激素干扰中的应用,以及目前存在的问题作一综述。

PcDNA3.1(+)/CYP11B2真核表达质粒的构建及其在NCI-H295R细胞中的表达

目的构建人醛固酮合成酶基因(CYP11B2)的真核表达质粒,并在人肾上腺上皮细胞(NCI-H295R)中表达,为下一步定点突变研究奠定基础。方法从人的肾上腺组织中提取总的RNA,采用RT-PCR扩增法扩增人的CYP11B2全长cDNA并克隆到PMD18-T载体中,然后再亚克隆于PcDNA3.1(+)真核表达载体,通过菌液PCR和酶切鉴定重组真核表达质粒,并以DNA测序证实。利用阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染NCI-H295R,RT-PCR和放射免疫法(RIA)检测CYP11B2基因的表达。结果菌液PCR扩增和酶切证实真核表达质粒构建成功,测序表明CYP11B2基因cDNA全长(1 509bp)和GenBank上公布的序列(D13752)相比较,存在一个碱基差异A3323G,这个变异使得第173位的赖氨酸变为精氨酸,核苷酸序列的同源性为99.9%,氨基酸序列的同源性为99.8%。真核表达质粒转染人肾上腺上皮细胞后CYP11B2 mRNA表达增加,细胞上清中的醛固酮含量显著增加。结论①通过查阅国外SNP数据库得知K173R为一个SNP位点,编号为rs4539。②成功构建了人CYP11B2基因的真核表达质粒,阳离子脂质体是NCI-H295R有效的体外转染体系,本实验为进一步研究该基因的结构与功能关系奠定了基础。

类固醇生成因子-1基因沉默对人肾上腺皮质腺癌H295R细胞的作用及其临床意义

目的研究类固醇生成因子-1（SF-1）基因下调对人肾上腺皮质腺癌H295R细胞的影响，并探讨SF-1在肾上腺肿瘤发病中的作用。方法用含SF-1特异性短发夹（shRNA）序列的质粒载体pGenesill—SF1shRNA及含非特异性序列的阴性对照质粒pGenesill—negative-shRNA分别转染H295R细胞。48h后用蛋白质印迹法和荧光定量PCR检测SF-1表达水平。WST-1法及细胞计数法检测转染后细胞增殖情况，免疫组化SABC法检测转染后各细胞组中Ki67表达，TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果SF-1-shRNA有效地抑制了SF—1的表达，在蛋白水平和mRNA水平的抑制率分别为69．07％和71．02％（P〈0．01）。WST-1及细胞计数法均显示SF-1基因沉默组细胞增殖缓慢，增殖明显受到抑制（P〈0．01）；而TUNEL结果恰好相反，荧光镜下SF-1基因沉默组凋亡细胞的数目及形态均比较明显，凋亡细胞数约为阴性对照组的3．7倍（P〈0．01）；SF-1基因干扰后，其Ki-67阳性细胞率要低于阴性对照组细胞，分别为（16．90±2．17）％和（33．48±3．16）％（P〈0．01）。结论SF-1基因沉默可抑制肾上腺皮质腺癌细胞增殖，有望成为研究肾上腺肿瘤发病机制及其治疗的重要分子。

H295R细胞系筛选环境类固醇激素干扰物的研究进展

H295R细胞系能表达类固醇激素合成过程中涉及的所有酶类,生成肾上腺皮质合成的所有类固醇激素,且与正常的人肾上腺细胞对毒物的反应水平有很好的相关性,能从基因表达、酶活力和激素三个层面体外筛选环境类固醇激素干扰物和研究其作用机制,已成为体外筛选环境类固醇激素干扰物最具潜力的工具。笔者就H295R细胞系在环境类固醇激素干扰物筛选中的应用及存在的问题进行了综述。

顺式联苯菊酯对映体对H295R细胞肾上腺皮质激素分泌的选择性干扰效应

[背景]手性农药是指分子结构中含有手性中心的农药化合物,含有一对或多对呈镜像关系的对映异构体(简称对映体)。顺式联苯菊酯(cis-bifenthrin,cis-BF)是当前应用较为广泛的一种手性拟除虫菊酯农药,含有1S-cis-BF和1R-cis-BF两个对映体。cis-BF是一种潜在的内分泌干扰物,有研究发现,cis-BF对下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴分泌的糖皮质激素和盐皮质激素受体具有明显的拮抗效应,但关于cis-BF对映体对HPA轴激素合成分泌的选择性干扰效应及其机制仍不甚明了。[目的]探讨手性农药cis-BF对映体对人肾上腺皮质癌(H295R)细胞肾上腺皮质激素(皮质醇和醛固酮)分泌水平的影响及其分子机制。[方法]利用高效液相色谱仪对cis-BF进行手性拆分,用圆二色谱仪对单个对映体(1S-cisBF/1R-cis-BF)构型进行鉴定,用气相色谱对单个对映体浓度进行分析。体外培养H295R细胞,以不同浓度(0、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6、1×10^-5 mol/L)1S-cis-BF/1R-cis-BF染毒细胞,用单溶液噻唑兰(MTS)比色法检测细胞增殖活性,确定染毒浓度。以无细胞毒性浓度(0、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7 mol/L)1S-cis-BF/1R-cis-BF处理细胞24 h,采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(real-time PCR)检测肾上腺皮质激素合成相关酶基因的表达水平,用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量和细胞上清液中皮质醇、醛固酮水平。[结果]利用高效液相色谱仪完成cis-BF对映体的拆分,两种对映体1S-cis-BF和1R-cis-BF纯度分别高达99.5%和99.2%。MTS实验结果显示,与对照组相比,1×10^-6和1×10^-5 mol/L浓度组细胞增殖活性升高(P<0.05),而1×10^-9、1×10^-8和1×10^-7 mol/L 1S-cis-BF/1R-cis-BF对H295R细胞增殖活性无明显影响。PCR结果显示,相对于对照组,1×10^-7 mol/L1S-cis-BF可下调类固醇合成急性调节蛋白(St AR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3βHSD2)和17α-羟化酶(CYP17)的mRNA水平(P<0.05);1×10^-8、1×10^-7 mol/L1R-cis-BF可下调3βHSD2 mRNA水平(P<0.05),且在1×10^-7 mol/L浓度组St AR、3βHSD2和CYP17 mRNA水平具有对映体差异,1S-cis-BF的抑制作用分别是1R-cis-BF的2.23、2.04和5.00倍(P<0.05)。cAMP测定结果显示,1×10^-7 mol/L 1S-cis-BF染毒致细胞内cAMP含量相对于对照组下降了8.10%(P<0.05),而1R-cis-BF与对照组差异无统计学意义;且1×10^-7 mol/L浓度组cAMP含量有明显的对映体差异,1S-cis-BF的抑制作用高于1R-cis-BF(P<0.05)。激素测定结果显示,与对照组相比,所有浓度组(1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7 mol/L)皮质醇分泌水平均明显降低(P<0.05),1×10^-9、1×10^-7 mol/L1S-cis-BF及1×10^-7 mol/L1R-cis-BF组醛固酮分泌水平明显降低(P<0.05);其中在1×10^-8 mol/L浓度组,S型对映体对皮质醇分泌水平的抑制作用是R型对映体的1.68倍,在1×10^-7 mol/L浓度组,S型对映体对醛固酮分泌水平的抑制作用是R型对映体的2.16倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]cis-BF对映体通过降低c AMP水平,下调c AMP依赖性类固醇激素合成酶mRNA的表达而抑制H295R细胞内皮质醇和醛固酮的分泌水平,且1S-cis-BF的干扰效应明显高于1R-cis-BF。

淫羊藿苷对H295R细胞维生素D系统相关蛋白表达及孕酮、孕烯醇酮分泌的影响

目的:探讨淫羊藿苷对人肾上腺皮质细胞(H295R细胞)维生素D系统及孕酮、孕烯醇酮相关基因表达的影响。方法:MTT法检测不同浓度的淫羊藿苷和维生素D对H295R细胞增殖率的影响。ELISA法检测孕酮、孕烯醇酮分泌水平。RT-qPCR检测VDR、CYP27B、CYP24A、CYP17A1、CYP21 mRNA表达。Western blot法检测VDR、CYP27B、CYP24A蛋白表达。结果:淫羊藿苷10-8 mol/L浓度,维生素D在0.25×10-11 mol/L和0.5×10-11 mol/L浓度,对H295R细胞增殖无显著影响。而淫羊藿苷10-4 mol/L,维生素D在2×10-11 mol/L和4×10-11 mol/L浓度时对H295R细胞增殖存在一定抑制作用。与对照组比较,维生素D组与淫羊藿苷10-5 mol/L、10-6 mol/L组的VDR、CYP27B mRNA与蛋白表达明显上调,维生素D组与淫羊藿苷10-6 mol/L、10-7 mol/L组的CYP24A mRNA与蛋白表达则明显下调,维生素D组与淫羊藿苷各剂量组孕酮、孕烯醇酮分泌水平均明显下降,维生素D组与淫羊藿苷10-6 mol/L组CYP17A1、CYP21 mRNA表达均明显上调。结论:淫羊藿苷可能通过调节H295R细胞维生素D系统对孕酮、孕烯醇酮合成分泌产生影响。

黄芪多糖对LPS诱导H295R细胞损伤的维生素D系统关键酶表达及皮质酮分泌的影响

目的研究黄芪多糖对脂多糖(LPS)诱导H295R细胞损伤的维生素D系统关键酶(CYP27B、CYP24A)及皮质酮表达的影响。方法用LPS溶液建立H295R细胞损伤模型。MTT法检测不同浓度的黄芪多糖对H295R细胞增值率的影响。分组:对照组,模型组,模型+黄芪多糖低、中、高剂量组,模型+维生素D组。ELISA法检测各组皮质酮分泌水平。RT-qPCR检测各组CYP27B、CYP24A、CYP11B1 mRNA表达。Western blot法检测各组CYP27B、CYP24A蛋白表达。结果黄芪多糖12.5μg/mL浓度对H295R细胞增值无显著影响,200μg/mL浓度时对H295R细胞增值存在一定抑制作用。与对照组比较,模型组皮质酮水平、CYP11B1 mRNA表达均显著上调(P<0.05),CYP27B mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05),CYP24A mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05);与模型组比较,黄芪多糖100μg/mL组和维生素D组皮质酮水平、CYP11B1 mRNA表达均显著下降(P<0.05),CYP27B mRNA和蛋白显著下调(P<0.05),CYP24A mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论黄芪多糖可改善受损H295R细胞皮质酮分泌失调,可能与调节维生素D系统关键酶CYP24A、CYP27B表达有关。

黄芪多糖离体条件下对H295R细胞维生素D系统相关蛋白表达及睾酮分泌的影响

目的:探讨黄芪多糖对人肾上腺皮质细胞(H295R细胞)维生素D系统及睾酮表达的影响。方法:随机分为空白对照组、维生素D组、黄芪多糖25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL组,四唑盐(MTT)法检测不同浓度的黄芪多糖和维生素D对H295R细胞增殖率的影响,ELISA法检测睾酮分泌水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测维生素D受体(VDR)、25-羟基维生素D3-1α-羟化酶(CYP27B)、维生素D3-24-羟化酶(CYP24A)、17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)、19α-羟化酶(CYP19A1)mRNA表达,Western blot法检测VDR、CYP27B、CYP24A蛋白表达。结果:黄芪多糖12.5μg/mL浓度,维生素D在0.25×10^-11 mol/L和0.5×10^-11 mol/L浓度,对H295R细胞增殖无显著影响。黄芪多糖200μg/mL,维生素D在2×10^-11 mol/L和4×10^-11 mol/L浓度时对H295R细胞增殖存在一定抑制作用。与空白对照组比较,维生素D组与黄芪多糖100μg/mL组睾酮分泌水平显著升高,VDR、CYP24A、17β-HSD mRNA表达显著上调,CYP27B蛋白及mRNA、CYP19A1 mRNA表达明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论:离体条件下,黄芪多糖可能通过调节H295R细胞维生素D系统促进睾酮合成分泌。

淫羊藿苷对H295R细胞睾酮分泌及VDR、CYP19A1 mRNA表达的影响

目的探讨淫羊藿苷对人肾上腺皮质细胞(H295R细胞)睾酮分泌及相关基因表达的影响。方法将H295R细胞随机分为5组,即对照组,淫羊藿苷低(10-7mol/L)、中(10-6mol/L)、高(10-5mol/L)剂量组,维生素D组(10-11 mol/L)。ELISA法检测睾酮分泌水平;RT-qPCR检测VDR、CYP19A1 mRNA表达。结果与对照组比较,维生素D组与淫羊藿苷低、中、高组睾酮分泌水平均较低(P<0.05);与对照组比较,维生素D组与淫羊藿苷高、中剂量组VDR mRNA表达上调(P<0.05)。维生素D组与淫羊藿苷高剂量组CYP19A1 mRNA表达均上调(P<0.05)。结论淫羊藿苷可能通过调节H295R细胞VDR mRNA的表达对睾酮分泌产生影响。

污水处理厂中典型内分泌干扰物的去除效果研究

内分泌干扰物(Endocrine Disruption Chemicals,EDCs)在水中极低浓度下即会引起水生生物生殖发育、神经和免疫系统的异常,对人群的健康危害不容忽视。EDCs在污水厂中具有低浓度、难去除的特点,为进一步阐明污水处理厂不同处理工艺对此类EDCs的去除效果,采用化学分析法(气质联用法)和生物学方法(H295R和MVLN细胞实验法)分析东莞市2个城市污水处理厂中8种典型EDCs的分布特征和去除效果。结果显示,两污水厂进水中壬基酚(Nonlyphenol,NP)、辛基酚(Octylphenol,OP)、双酚A(Bisphenol A,BPA)浓度较高,NP质量浓度分别高达10 782 ng·L^(-1)和2 664 ng·L^(-1),而雌激素类物质雌酮(Estrone,E1)、雌二醇(17β-Estradiol,E2)与雌三醇(Estriol,E3)、17α-乙炔基雌二醇(17α-Ethinglestradiol,EE2)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)浓度较低,经处理后,去除效率均超过90%。两污水厂进水及出水处理后H295R细胞内雌二醇(E2)水平显著升高,睾酮(Testosterone,T)水平呈下降趋势,类固醇合成基因HMGR、CYP11B2和CYP19表达量显著增加。MVLN细胞试验结果显示,两污水厂出水中雌激素当量(Estradiol Equivalency quotient,EEQ)分别达19.25ng·L^(-1)和14.21 ng·L^(-1)。本研究表明,即使化学分析结果显示EDCs去除率高达90%,且出水中雌激素化合物低于检出限,但是出水中类固醇激素干扰活性及雌激素活性依然存在。类固醇激素水平与水中酚类物质浓度没有显著相关性,A、B两个污水厂出厂水中除酚类化合物外,其他产生雌激素效应的化合物或类固醇合成干扰物也不容忽视。

类固醇生成因子-1基因沉默在介导血管紧张素Ⅱ对醛固酮分泌调控的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ（ATⅡ）刺激人肾上腺皮质癌H295R细胞后醛固酮合成酶（CYP11B2）mRNA及醛固酮激素的改变,探讨类固醇生成因子-1（SF-1）基因沉默在介导该反应中的作用.方法 用携带U6启动子和SF-1特异性短发夹RNA（shRNA）序列的质粒载体pGenesil1-SF-1-shRNA及含非特异性shRNA编码序列的阴性对照质粒pGenesill-negative-shRNA转染人肾上腺皮质癌H295R细胞,应用Westem blot和荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测SF-1表达的改变,以100 nmol/L浓度ATⅡ刺激实验组和对照组细胞,检测ATⅡ刺激后3、6、9、12、15、18 h时间点CYP11B2 mRNA表达水平,与未刺激时对比,检测两组细胞CYP11B2 mRNA的最大增幅.用放射免疫法测定醛固酮激素在ATⅡ刺激24 h后的分泌水平,对比两组细胞醛固酮增幅.结果 实验组细胞SF-1在蛋白水平和mRNA水平分别下降了69.07%和71.20%（P＜0.01）.ATⅡ刺激后12 h时CYP11B2 mRNA表达水平最高,与未刺激前比较,实验组和对照组的CYP11B2 mRNA增幅分别是50.21倍和800.09倍（P＜0.01）,后者是前者的15.93倍（P＜0.01）.同样,ATⅡ刺激后醛固酮激素分泌水平均升高,对照组细胞刺激前后分别为（0.061±0.007）μg/L和（0.256±0.014）μg/L（P＜0.01） 而实验组醛固酮激素在ATⅡ刺激前后则分别为（0.101±0.010）μg/L和（0.252±0.016）μg/L（P＜0.01）,两组比较,前者增幅高于后者1.7倍（P＜0.01）.结论 SF-1表达下调可以降低CYP11B2 mRNA及醛固酮对ATⅡ的敏感性和反应性.

ACTHR在介导血管紧张素Ⅱ和氯化钾对醛固酮分泌调控中的实验研究

目的研究血管紧张素Ⅱ（AT-Ⅱ）和氯化钾刺激人肾上腺皮质癌H295R细胞后醛固酮合成酶（CYP11B2）mRNA及醛固酮激素的改变情况，并探讨促肾上腺皮质激素受体（ACTHR）在介导该反应中的作用。方法用慢病毒包装的ACTHR高表达载体感染H295R细胞作为实验组。空载体病毒转染组细胞为对照组。应用免疫印迹Westernblot和荧光定量PCR法验证ACTHR表达情况。分别用100nmol／LAT-Ⅱ及16mmol／L氯化钾刺激各组细胞，刺激24h后测定CYPllB2mRNA表达水平，对比2组细胞CYP11B2mRNA增幅情况。用ELISA试剂盒测定醛固酮激素的含量，对比2组细胞醛固酮增幅情况。结果实验组细胞ACTHR在蛋白水平和mRNA水平分别增加2．4倍和18倍（P〈0．05）。AT-Ⅱ刺激24h后实验组细胞CYP11B2 mRNA表达水平较对照组细胞高1．7倍，2组细胞醛固酮激素水平分别为（121．98±8．31）ng／L和（104．05±6．88）ng／L，前者增幅为后者的2．06倍（—P〈0．05）；氯化钾刺激各组细胞24h后，实验组细胞CYP11B2mRNA表达水平较对照组细胞高19．2倍，2组细胞醛固酮激素水平分别为（137．67±10．35）ng／L和（104．05±6．88）ng／L，前者增幅为后者的3．13倍（P〈0．05）。结论ACTHR高表达可增加醛固酮对AT-Ⅱ和氯化钾刺激的敏感性，有望成为研究原发性醛固酮增多症重要突破口。

内皮素-1和血管紧张素Ⅱ对肾上腺皮质癌细胞ERK1/2磷酸化的交互作用

目的:内皮素1(ET-1)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)均能刺激肾上腺皮质细胞增殖,促进球状带细胞分泌醛固酮,但是,两者联合作用对皮质细胞产生的影响目前研究较少,涉及的信号传导通路尚不清楚。本实验拟研究ET-1和An-gⅡ联合处理对肾上腺皮质癌H295R细胞的ERK磷酸化的影响。方法:不同剂量ET-1和AngII刺激H295R细胞,用Western blot检测ERK1/2磷酸化水平;用AngⅡ 1型受体拮抗剂坎地沙坦及ETA拮抗剂BQ610预处理细胞,再加入ET-1及AngⅡ单独或共同刺激细胞,Western blot检测磷酸化ERK1/2。结果:ET-1和AngII均呈剂量依赖性刺激细胞ERK1/2磷酸化,两者的最佳刺激剂量均为100 nM;ETA受体拮抗剂BQ610能完全阻断ET-1的作用,而AngⅡ 1型受体拮抗剂坎地沙坦完全阻断AngⅡ的作用。ET-1和AngⅡ共处理细胞与两者单独刺激细胞在ERK1/2激活上无明显改变。结论:ET-1和AngII均激活H295R细胞ERK,且两者无交互作用。