人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达。方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达。结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光。结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系。

水稻组蛋白H2B.7基因的分离和表达模式研究

选取水稻组蛋白H2B的H2B.7基因进行了表达模式分析,发现其在水稻根、茎、叶和穗等组织中为组成型表达,但在激素和胁迫处理时表达模式发生变化,如在2,4-D、α-萘乙酸(NAA)、乙烯以及热激处理时表达水平上调,在激动素(KT)和多效唑处理时表达水平下调,说明水稻组蛋白H2B.7基因的表达在植物内外环境变化时也会相应发生改变.

红蓝荧光细胞的构建

目的:构建人组蛋白H2B基因与蓝色荧光蛋白(BFP)融合的真核表达质粒,使其能在黑色素瘤细胞(B16细胞)中表达,形成在核区可以发出肉眼可见的蓝色荧光,胞质区发出肉眼可见红色荧光的双色荧光细胞。方法:采用普通PCR扩增得到BFP序列,通过反转录PCR(RT-PCR)从含有腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞(293细胞)中扩增获得H2B基因的部分c DNA序列。将BFP序列、H2B基因与p Retro X-Tight-Pur载体质粒来构建真核表达质粒(p Retro X-BFP-H2B),对其进行酶切并用普通PCR方法进行鉴定。采用脂质体转染技术将p Retro X-BFP-H2B重组质粒转染细胞质中能表达红色荧光蛋白(RFP)的B16细胞并观察融合蛋白的表达。结果:成功构建p Retro X-BFP-H2B质粒,经转染后的双荧光细胞可以呈现出双荧光的效果,转染后也能稳定地表达传代。结论:本研究为双色荧光细胞的构建及其荧光蛋白种类的选用提供了新的参考。

基于大样本转录组学数据分析组蛋白1H2BH在脑胶质瘤中的表达及生物学功能

目的探讨影响脑胶质瘤恶性进展、患者生存预后的关键基因及其在脑胶质瘤中的表达特征和临床意义。方法回顾性分析中国脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)RNA测序数据库310例、癌症基因组图谱(TCGA)RNA测序数据库699例、GSE16011 mRNA芯片数据库268例和REMBRANDT mRNA芯片数据库中317例脑胶质瘤患者的临床资料及其脑胶质瘤样本的测序数据,筛选出与患者预后相关的共同差异基因,通过文献检索确定目标基因。在上述4个数据库中评价该目标基因的表达特征。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线及单因素和多因素Cox回归分析法评价该目标基因对脑胶质瘤患者预后的作用。通过Pearson相关检验,筛选出CGGA和TCGA数据库中与目标基因表达呈正相关(r>0.5且P<0.05)的基因,进一步利用在线软件DAVID对其进行生物功能聚集分析。采用实时荧光定量聚合酶联链式反应(qRT-PCR)检测星形细胞株和脑胶质瘤细胞株中该基因的表达量。采用细胞免疫荧光染色法检测经药物处理后脑胶质瘤细胞株(U87、U251和LN229)中γ-H2AX蛋白的表达情况。结果经筛选,组蛋白1H2BH(HIST1H2BH)为目标基因。在上述4个数据库中,HIST1H2BH的表达量在世界卫生组织(WH0)Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ级间的差异均有统计学意义(均P<0.01),其中在Ⅳ级中最高,Ⅱ级中最低;且HIST1H2BH在异柠檬酸脱氢酶(IDH)野生型脑胶质瘤中的表达量均高于IDH突变型(均P<0.001)。在CGGA和TCGA数据库中,全级别脑胶质瘤和胶质母细胞瘤患者,HIST1H2BH高表达组的总体生存率均低于低表达组(均P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,HIST1H2BH表达量高是影响脑胶质瘤患者总生存期的危险因素(HR=1.275,95%CI:1.040~1.563,P<0.05)。生物功能富集分析结果显示,与HIST1 H2BH表达量呈正相关的基因主要参与细胞增殖、DNA损伤修复和细胞外基质调控。qRT-PCR结果显示,HIST1 H2BH在HA、U87、U251和LN229细胞株中相对表达量的差异有统计学意义(分别为1.03±0.03、1.62±0.08、3.41±0.27、2.86±0.20,P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示,经替莫唑胺处理后,U87细胞株的γ-H2AX蛋白的表达水平较U251和LN229细胞株增加(P<0.05)。结论HIST1 H2BH在脑胶质瘤中的表达随病理学级别的升高而增加,是影响脑胶质瘤患者生存期的危险因素,可能与其参与DNA损伤修复从而引起肿瘤细胞耐药有关。