2株海鸭源H3亚型禽流感病毒全基因组分子特征分析

【目的】了解广西沿海地区水禽H3亚型禽流感病毒的基因组分子特征。【方法】本研究通过RT-PCR一步法分段扩增法,对2020年从广西沿海地区分离到的2株海鸭源H3亚型禽流感病毒A/duck/Guangxi/S11359/2020(H3N1)与A/duck/Guangxi/S11374/2020(H3N8)进行全基因组测序与进化分析。【结果】2株H3亚型禽流感病毒的HA蛋白裂解位点序列均为340 PEKQTR↓GLFG 349,为低致病性禽流感病毒的分子特征,与受体嗜性关联的第226、228位氨基酸均为Q和T,可能仍主要结合禽类受体;BLAST分析结果显示,本研究H3N1亚型禽流感病毒的M、NP基因及H3N8亚型禽流感病毒的PA基因,与H7亚型禽流感病毒相似性最高,分别为99.5%、98.7%和98.9%,表明H3可能与H7亚型禽流感病毒发生了基因交换;2株H3亚型禽流感病毒与越南、孟加拉国、韩国等周边国家水禽源的H3、H4、H6、H7、H9等亚型相似性较高,可能拥有相同的进化来源;遗传进化分析表明,H3亚型禽流感病毒各基因进化分支均属于欧亚谱系,与水禽源毒株遗传距离较近,犬源、猫源的毒株次之,人源、猪源的毒株较远,但H3N1亚型禽流感病毒的NS基因与日本早期人源流感毒株A/Aichi/2/1968遗传关系最近,可能发生了基因置换。H3N8亚型禽流感病毒的HA基因检测有重组信号,重组的亲本毒株分别为A/duck/Beijing/40/04(相似性为93.1%)和A/canine/Beijing/20121215-34/2012(相似性为97.1%)。【结论】广西沿海地区的2株H3亚型禽流感病毒基因来源复杂,表现出遗传多样性特征。

逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。

1996～2005年中国H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶基因特性分析

测定了1996～2005年间在中国分离并保存的395株H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶（NA）基因序列，应用生物信息学工具进行了分析。结果表明：NA基因序列的进化树表现为一主要进化主干伴随多侧分支进化，同一年份的毒株可以分为几个分支存在；疫苗株在NA基因序列进化树上存在明显的滞后现象；NA没有氨基酸的丢失与插入；抗原决定簇大部分位点保守且各抗原决定簇之间的变异情况各有特点，其中197～199位、431～434位和339～347位点的变异频率最高，而153位、328～336位、367～370位、400～403位抗原决定簇的氨基酸变异频率相对比较小；除了抗原决定簇外还有些氨基酸位点的变异频率很高，它们分别是18、23、30、93、143、208、216、221、249、265、267、307、385、437位氨基酸，其中143位和267位这两个位点的变异频率高于抗原决定簇位点，具体生物学意义还需要进一步研究；NA蛋白的酶活性中心位点高度保守；二硫键和糖基化位点保守。NA基因的这些特点为流感的预防、控制以及NA抑制剂药物的应用提供了一定的参考依据。

2011—2015年环洞庭湖区H3亚型禽流感病毒的分离鉴定与遗传演化

为了解环洞庭湖地区家禽H3亚型禽流感病毒的感染情况和进化规律,笔者对2011—2015年湖南省环洞庭湖地区的多个活禽市场与散养鸭场分离的31株H3亚型禽流感病毒进行基因测序和进化分析。结果表明:所有病毒的HA裂解位点不含连续的碱性氨基酸,为低致病性禽流感病毒的分子特征;各基因片段进化树显示部分病毒的PA与PB2基因与H5在相同分支,部分病毒的NP、PA、PB1与H7处于相同分支,表明H3可能与H5、H7亚型的禽流感病毒发生了复杂的基因交换;散养家禽分离的部分H3亚型禽流感病毒内部基因与越南、韩国等周边国家野鸟源的H3、H6、H7、H11等亚型同源性较高,可能有相同的进化来源。进一步将分离的病毒进行全基因比对,可划分出21种不同的病毒基因型。环洞庭湖地区H3亚型禽流感病毒基因来源复杂,表现出明显的遗传多样性。

应用TaqMan荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒

为建立马流感病毒(EIV)的检测方法,本试验针对H3N8亚型EIV血凝素(HA)基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法。经用TaqMan荧光定量PCR、RT-PCR和病毒分离方法分别检测新疆等省135份疑似EIV马鼻拭子样品,其结果表明:3种方法的马流感检出率分别为54.07%、37.78%、0.89%;TaqMan荧光定量PCR可检出马流感病毒基因组RNA的灵敏度可达10拷贝/反应,而且与其他马呼吸道病毒均无交叉反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性。该方法为H3N8亚型马流感的早期诊断及分子流行病学调查等提供了一种新的快速、准确的定量检测技术。

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×103拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。

深圳市2007年H3N2亚型流感病毒基因特性分析

目的了解深圳市2007年H3N2亚型流感病毒流行情况及血凝素基因特性。方法用狗肾传代细胞(MDCK)和鸡胚进行流感病毒分离。收获病毒后提取病毒RNA,进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送大连宝生物公司纯化及测序。测序结果用Simmonic软件和Mega3.1软件进行序列分析。结果H3N2亚型流感毒株为深圳市2007年流感流行的优势株,与2006年的深圳株比较未发生明显变异,但与2007年的疫苗株相比,有多个位点的氨基酸发生了替换,造成了其间的抗原性发生了一定的变化。结论深圳市2007年H3N2亚型流行株,并未形成一个新的变种。推测是由于与疫苗株之间的抗原性的变异导致了2007年深圳市H3N2亚型流感的流行。

H3N2亚型猪流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

采用RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒HA1基因。将该片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中,构建原核表达载体pET-HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21,经IPTG诱导,HA1基因获得表达,其重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定表达HA1基因的最佳诱导条件。Western blot分析表明表达产物具有良好的抗原活性。用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测H3亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,阳性标准初步判定为:待检血清OD值>0.4,而且待检血清OD值/阴性血清OD值>2。应用此方法对309份临床血清样品进行了检测,并与HI方法进行了比较,结果表明基于重组HA蛋白的间接ELISA方法可用于H3N2亚型猪流感病毒感染的初步诊断。

H3亚型禽流感病毒的分离与鉴定

为了解广西H3亚型禽流感病毒在家禽中的流行情况,对2009~2014年采集的活禽棉拭子样品进行了分离与初步鉴定,共分离纯化出14株H3亚型AIV,通过对HA和NA基因克隆、序列测定,进一步确定11株为H3N2亚型,2株为H3N6亚型,1株为H3N8亚型AIV。对分离株进行鸡胚半数致死量、半数感染量（EID50）的测定与受体亲和性试验,结果显示14株分离株均具有优先结合SA唾液酸α-2,3-Gal受体的能力,属于禽源流感病毒毒株,不具备感染人的潜能。

3株H3N8亚型禽流感病毒对SPF鸡和Balb/c小鼠致病性研究

为了解从洞庭湖区鸭子和环境中分离的3株H3N8亚型禽流感病毒的致病性。利用这3株毒株对SPF鸡及Balb／c小鼠进行致病性试验，结果显示，3株毒株均能使鸡感染并排毒，但不引起鸡明显的临床症状及死亡，感染鸡后第3天～第7天在泄殖腔排出高滴度病毒，且持续至第11天（仅观察到该天），与以往的研究相比，排毒时间更长。3株H3N8亚型毒株感染小鼠后，能在小鼠鼻甲及肺脏内高滴度复制，但小鼠的体重变化不明显。结果说明3株H3亚型AIV对家禽及哺乳动物感染能力增强，因此加强该亚型的流行病学监测及致病性的研究非常重要。

H3N8亚型马流感病毒HA1基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法从马流感病毒中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)中扩增的HA1基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,测序正确后转化入Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌表达出约53ku,以沉淀性形式存在的重组蛋白,且在37℃,0.4mmol/L IPTG条件下诱导8h表达效果最好。表达产物经切胶纯化后得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot分析,表达的蛋白与抗马流感病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。

贵州省2010年H3N2亚型流感病毒HA1基因序列分析

目的了解2010年贵州省H3N2亚型流感病毒HA1基因变异特征。方法用MD-CK细胞分离流感病毒,采用血凝抑制试验分型鉴定,随机选取8株H3N2亚型流感毒株进行RNA提取,逆转录扩增获得HA1基因产物,将其进行基因产物测序,测定的序列用相关的生物信息软件进行分析。结果贵州省各代表株在同一分支。该分支与2008-2009年疫苗推荐株A/Brisbane/10/2007(H3N2)接近,与WHO 2010年疫苗推荐株A/Perth/16/2009(H3N2)相距较远。结论2010年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对该年我市H3N2亚型流感预防效果不好,以至于H3亚型在我省成为优势株,引起广泛流行。

广西医科大学2007年新生H3N2亚型流感病毒抗体调查

目的:调查广西医科大学2007年新生H3N2亚型流感病毒抗体,了解健康青年人群血清中H3N2亚型流感病毒抗体的水平,从而预测广西H3N2流感病毒引起的流感流行的趋势。方法:抽取广西医科大学2007年新生血清168份,通过血凝抑制实验进行抗体检测。结果:以血凝抑制抗体滴度≥1:10为H3N2亚型流感病毒抗体阳性,H3N2亚型流感病毒抗体阳性率为26.19%,抗体滴度≥1:40的占阳性的22.73%。结论:H3N2亚型流感病毒引起的流感在广西有流行,但流行强度不高,抗体滴度水平对人群的保护能力较低。

一株H3亚型野鸟源禽流感病毒血凝素基因序列分析

为了解野鸟在传播禽流感病毒中的作用,贵州省动物疫病预防控制中心定期从威宁草海采集候鸟和留鸟的新鲜粪便,用RT-PCR方法检测病原核酸。监测到1份流感病毒阳性样本,对其血凝素(HA)基因进行了克隆和测序。结果发现,该病毒属于H3亚型,所获得的HA基因1794bp,包含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸残基,包括6个潜在的糖基化位点,遗传进化分析结果显示其属于欧亚禽源分支。另外,HA受体结合位点上的氨基酸序列具有禽源特有的保守性,分别是154A、206E、210L、241G、242Q和244G。推导的HA裂解位点有典型的低致病特征(PEKQTR/GLF)。结果表明,贵州省野鸟中存在低致病性H3亚型禽流感病毒。

H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定

以灭活马流感病毒(EIV)A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经常规细胞融合后,用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA方法筛选获得3株(3C2、5G10和5A10)能稳定分泌H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。其中3C2和5G10为IgG2α,5A10为IgM亚类,腹水抗体效价检测显示,3C2和5G10为1∶64 000,5A10为1∶32 000。HI和Western blot结果表明,3株单克隆抗体均为EIV血凝素特异性单克隆抗体。特异性试验结果表明,所获得的mAb不与H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒(EAV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马日本脑炎病毒(JEV)发生交叉反应。研究为建立单克隆抗体介导的检测马流感病毒抗原和抗体的血清学方法以及为实现马流感标准化诊断奠定基础。

不同治法体内抗甲3(H_3N_2)亚型流感病毒作用的实验研究

目的:探讨辛凉解表、辛温解表及祛湿解表等不同治法在体内抗甲3(H3N2)亚型流感病毒的作用。方法:三种治法的代表方分别选择银翘散、桂枝麻黄各半汤和新加香薷饮,设正常对照组、阳性药物(病毒唑)组和三种治法组,分别观察不同治法对甲3(H3N2)亚型流感病毒小鼠肺炎的影响,对小鼠感染甲3(H3N2)亚型流感病毒的死亡保护作用和延长生命作用。结果:以肺指数为评价指标,三种不同治法组与模型对照组相比(P<0.01),差异有统计学意义;三种不同治法组之间比较以及三种不同治法组和阳性药物组之间比较,差异无统计学意义。不同处理组间死亡率比较和不同处理组间存活时间的比较,差异无统计学意义。结论:三种不同治法对甲3(H3N2)亚型流感病毒小鼠肺炎均有抑制作用,但三种不同治法之间以及三种不同治法和阳性药物之间作用并无差异性。三种治法对小鼠感染甲3(H3N2)亚型流感病毒的死亡保护作用和延长生命作用均不明显。

吉林省2018-2020年甲型H3N2亚型流感病毒耐药基因分析

目的掌握2018-2020年吉林省内H3N2亚型流感流行株对金刚烷胺类药物以及神经氨酸酶抑制剂类药物的耐药情况,为流感的临床治疗及预防控制提供参考依据。方法选取甲型H3N2亚型流感毒株34株,对M2和NA基因进行PCR扩增,测序后对耐药位点进行分析。结果2018-2020年吉林省分离到流感毒株981株,其中甲型流感病毒毒株934株,乙型流感毒株47株。在分离到的甲型流感病毒毒株中,57.49%为H1N1pdm亚型毒株,39.61%为H3N2亚型毒株。对34株H3N2亚型流感病毒测序结果显示M2基因S31N耐药位点上发生了突变;在NA耐药相关基因位点E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K、N294S均未发生突变。结论吉林省2018-2020年以甲型流感流行为主。34株甲型H3N2亚型流感病毒均对金刚烷胺类药物耐药,但仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。

2013—2014年南京市流感病毒H3N2亚型血凝素分子遗传特性分析

2013-2014年南京市流感病原监测系统分离到31株流感病毒H3N2亚型毒株,通过提取病毒RNA,反转录―聚合酶链反应（reverse transcriptase―polymerase chain reaction,RT―PCR）扩增血凝素（hemagglutinin,HA）基因片段,进行PCR产物纯化、测序并分析其遗传进化特征.结果显示,31株分离株与疫苗株A/Texas/50/2012之间的核苷酸和氨基酸进化距离分别为0.0102和0.0121,核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.9%~99.6%和97.2%~99.3%.遗传进化分析表明,分离株的HA基因分属不同的进化分支,3株2013年分离株属3B基因型,3株2014年分离株属3C.1基因型,2株2014年分离株属3C.2b基因型,其余23株属3C.3a基因型.与疫苗株相比,分离株的分子特征表现为发生N128A/T和P198S/A（去信号肽排列）氨基酸位点变异,均位于抗原决定簇B;分离株抗原决定簇上发生变异的位点共计24个;7株分离株出现126 NWT糖基化位点,3株分离株糖基化位点45NSS和144NNS消失.结果提示,2013-2014年南京市流感病毒H3N2亚型的HA基因较疫苗株发生了较大变异,疫苗对病毒的预防效果需重新评估.

H7N3亚型禽流感病毒分离株的生物学特性研究

为了了解经分离纯化、鉴定保存的1株鸭源H7N3亚型禽流感病毒株的一些生物学特性,参照判定禽流感致病性的标准方法对其进行生物学特性的研究.结果显示其鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TC ID50)及最小致死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为0.5×10-6.3mL-1、0.5×10-2.3mL-1及136.8 h;1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0;本毒株不引起鸭及BALB/c鼠的发病和死亡,这些都表明本毒株为低致病性禽流感病毒.

贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列分析

目的对贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列进行分析。方法提取核酸,PCR扩增,测序分析、比对。结果同源性分析和系统发育树都说明了相同(或相近)年份的毒株核苷酸序列同源性较高,亲缘关系较近;不同年份的毒株核苷酸序列的同源性较低,亲缘关系较远;3株H3N2毒株共有59各位点核苷酸替换。结论通过序列测定分析,结果表明1995-2005年纵向比较,贵州省甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列发生了变异;通过与Genbank上相应年份标准株横向比较,贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列未发生大的变异,仅有少数核苷酸的替换。