猪NR1H3基因可变剪接体的克隆及表达特性研究

旨在克隆猪NR1H3基因的可变剪接体,并预测编码蛋白的结构与功能,研究其转录本的表达特性。本试验以马身猪为研究对象,采用RT-PCR及克隆测序技术对猪NR1H3基因CDS区进行扩增和克隆,采用生物信息学方法分析NR1H3蛋白的生物学特性,采用qRT-PCR技术检测NR1H3基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、股二头肌、腰大肌和皮下脂肪组织中的表达谱及在脂肪组织中的发育性表达规律。结果表明,本研究成功克隆出猪NR1H3基因的两个转录本NR1H3-1和NR1H3-2,其中NR1H3-2为新发现的转录本(MN082630),其CDS区全长1203 bp,编码的蛋白质含400个氨基酸,属于中性不稳定蛋白;与NR1H3-1相比,NR1H3-2缺失了长度为95 bp的第9外显子,编码的蛋白质NR1H3-2比NR1H3-1少了一个肝X受体的配体结合结构域;氨基酸的相似性分析发现,猪NR1H3蛋白氨基酸序列与北大西洋小须鲸、山羊、绵羊、抹香鲸、长江江豚等物种的相似性较高。NR1H3-1和NR1H3-2在所检测组织中均有表达,且在不同组织间的表达量具有显著差异(P<0.05);NR1H3-1转录本在小肠中表达量最高,其次是脾、肝、股二头肌等,在心脏中表达量最低;NR1H3-2则在肝中表达量最高,其次是脾、小肠、胃和股二头肌等,在心脏中表达量最低。在各组织中(除小肠、心、肺),NR1H3-2的表达量均高于NR1H3-1,其中在肝和皮下脂肪组织中,NR1H3-2的表达量极显著高于NR1H3-1(P<0.01),在胃中差异达显著水平(P<0.05)。随着日龄的增加,皮下脂肪组织中NR1H3-1和NR1H3-2的表达量整体呈上升趋势,推测该基因对猪的脂肪沉积有调控作用。本试验成功克隆了猪NR1H3基因的两个可变剪接体,并推测其对猪脂质代谢及脂肪生成具有重要的生理作用。

菲律宾蛤仔重复序列28S rRNA及组蛋白H3基因的染色体定位

克隆了菲律宾蛤仔的28S rRNA基因（rDNA）及组蛋白H3基因,并应用FISH技术研究了它们在菲律宾蛤仔染色体上的定位情况.28S rDNA定位于一对中部着丝粒染色体的端部,在蛤仔的染色体上有一个位点;组蛋白基因定位于一对亚中部着丝粒染色体长臂的端部,在蛤仔的染色体上也有一个位点.28S rDNA基因和组蛋白基因的特异性定位准确地区分了菲律宾蛤仔的两对染色体,这两对染色体可以作为菲律宾蛤仔的染色体标记,为蛤仔统一核型的建立打下良好的基础, 也有利于对贝类细胞遗传学进行研究,同时还可辅助育苗产业的发展.

角类肥蛛Larinioides cornuta组蛋白H3基因保守序列克隆与分析

本文利用常规的PCR技术,克隆、测序园蛛科Araneidae角类肥蛛Larinioides cornuta组蛋白基因H3。将其H3基因与皿蛛科Linyphiidae11个种的组蛋白H3基因的序列,在1级结构、2级结构、蛋白质水平进行了比较,分析发现:组蛋白基因H3的序列A、T、C、G碱基的百分含量比较平均,分别为24.9%、23.2%、25.7%、26.3%;简约信息位点数74,多数分布在第3位点;平均替换率为0.15。平均转换/颠换比(R)为1.8,大于0.5;G-C,C-T间的替换是该区域进化的另一个显著特征;DNA1级结构高度保守的区段都不分布在2级结构“茎”区,不存在补偿性突变,2级结构的“环”(loop)区差异也很大;在氨基酸水平上所有成员非常保守。

非洲猪瘟病毒H3基因序列分析蛋白结构预测及其亚细胞定位

在前期研究中本实验室构建了敲除H3(Hypothetical protein 3)基因的非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株,并进一步通过动物实验表明敲除该基因对于ASFV的毒力没有影响,推测该蛋白可能是ASFV的非结构蛋白。为进一步了解ASFVH3基因及其编码蛋白的理化性质和结构特征,从NCBI数据库中搜集到71株包含H3基因的ASFV毒株进行序列比对并绘制了H3基因的分子进化树。利用在线软件分析ASFV H3蛋白的理化性质和组成结构,通过在HEK-293T细胞中转染真核表达质粒pRK-H3-GFP确定其亚细胞定位。结果表明,H3基因在Ⅰ型和Ⅱ型ASFV毒株中具有较高的同源性。H3蛋白包含35个氨基酸,等电点为5.49,相对分子质量为8648.38,氨基酸组成中丙氨酸、苏氨酸含量分别占37.1%、34.3%;其二级结构中,α-螺旋、β-折叠、无规卷曲分别占37.14%、25.71%、25.71%。制备了该蛋白的多克隆抗体,用荧光显微镜验证ASFV H3蛋白的表达。通过核定位序列预测该蛋白定位于细胞质和细胞核中;构建H3蛋白的真核表达质粒,通过间接免疫荧光试验证实该蛋白定位于细胞质和细胞核。这为进一步揭示H3基因功能奠定了一定基础,也为后续深入探讨H3基因功能提供了理论依据。

红苞凤梨AbF3′5′H基因上游调控因子筛选

颜色是观赏植物最重要的性状之一,也是当前观赏园艺育种的一个重要方向。为研究红苞凤梨红蓝色彩的呈现机制,初步分析金边红苞凤梨(Ananas comosus var.bracteatus)不同组织中花青素种类与含量,用AbF3′5′H基因启动子构建诱饵载体,利用酵母单杂交(Y1H)文库筛选其上游调控转录因子;并采用酵母单杂交验证技术,验证筛选出的转录因子与AbF3′5′H启动子的互作关系。结果表明:花青素的种类组成和相对比例决定了组织的颜色性状,AbF3′5′H是花青素合成途径种类分支的关键基因,在花青素种类组成与相对比例调控中具有重要作用;AbBTB/POZ、AbHSP81-1和AbGLOX能够与AbF3′5′H的启动子结合而调控其转录,可能在红苞凤梨花青素合成代谢调控中发挥重要作用。研究结果对于进一步揭示红苞凤梨花青素合成代谢调控机理,研究红苞凤梨呈色机理,培育叶色新品种有着重要的理论和实践意义。

红巴梨f3h基因的克隆及植物表达载体的构建

以成熟红巴梨果皮的总 RNA为模板,根据仁果类果树的 f3h基因的保守序列设计引物,利用 RT PCR方法从果皮中克隆出花青素生成相关基因 f3h基因的全长 cDNA,并将该片段连接到 pGEM T easy载体中。核苷酸序列测定表明,该基因全长1 095 bp,与苹果的f3h基因同源性高达92%,与矮牵牛相似系数达83%,与拟南芥相似系数达到82%。利用EcoRⅤ和BglⅡ对重组质粒进行酶切,回收 1 095 bp条带,并将其连接到 pBI121载体上,通过抗性筛选和PCR检测,证实了f3h基因已经构建到植物表达载体 pBI121上。

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。

NtC3H基因对烟草类黄酮及绿原酸合成的影响

为验证Nt C3H是否参与烟草中类黄酮和绿原酸等次生代谢物质的合成,构建了p CXSN::Nt C3H超量表达载体,利用农杆菌介导的叶盘转化法将Nt C3H基因转入野生型烟草三生烟,并通过HPLC检测转基因烟草中绿原酸以及芦丁、山奈酚芸香苷等类黄酮的含量变化。结果显示,与野生型三生烟草相比,转基因烟草叶片中绿原酸及芦丁的含量最高,分别提高了3.6倍和6.1倍,山奈酚芸香苷含量提高了24.6倍。研究结果证实了Nt C3H基因参与烟草中类黄酮和绿原酸等次生代谢物质的合成。

转cry1Ab/vip3H基因水稻对非靶标害虫褐飞虱连续多代生长发育与繁殖的影响

实验室条件下,转cry1Ab/vip3H基因水稻G6H1对褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育与繁殖的继代效应评价结果表明,不论是在苗期或是成株期,在各水稻品种上连续饲喂褐飞虱4代后,该虫各代的生长发育和繁殖参数都没有受到水稻品种的显著影响,即不论是在第1代、第2代还是第4代,取食G6H1与取食其非转基因亲本Xiushui 110相比,褐飞虱若虫的发育时间、成虫寿命和产卵量都没有显著差异。同时,2008年和2009年的田间调查结果表明,G6H1和Xiushui 110稻田间褐飞虱的若虫、成虫和成若虫总密度均无显著差异。

杨树木质素合成酶c3h基因的克隆及其序列分析

根据CYP98A3(GenBank登录号为AY064170)cDNA序列保守区设计引物,从正在分化的2年生‘欧美杨107’次生木质部提取的总RNA经RT-PCR扩增出一基因片段,然后与pMD20-T载体连接。重组质粒经限制性内切酶酶切、特异引物PCR扩增和测序鉴定。结果表明,扩增片段长度为994bp,其中包含一个长为495bp的开放阅读框,编码的氨基酸序列(登录号为CAP47423)与NCBI中AY064170的CYP98A3编码氨基酸序列的相似性为91%,初步断定其为CYP98A3家族中的一员,其cNDA序列GenBank登录号为AM920690。参照国内外已发表的部分植物的c3h基因序列,构建了c3h的遗传进化树,分析了不同植物c3h的遗传进化关系。

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。

长叶红砂黄烷酮-3-羟基转移酶3基因(RtF3H3)的克隆、表达分析及酵母表达载体的构建

黄烷酮-3-羟基转移酶(F3H)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂F3H3(Rt F3H3,GenBank登录号LC055546)基因,其开放阅读框长1 014 bp,编码338个氨基酸,推测蛋白分子量为38.46 k Da,理论等电点为5.7。通过定量RT-PCR研究发现,Rt F3H3在茎中表达量较高,在根和叶中表达量较低。不同程度Na Cl(100,300,500 mmol/L)和不同时间UV(12,24,36 h)胁迫都能诱导Rt F3H3基因表达量升高。另外,构建了Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。

红巴梨果实花青素生成相关基因f3h全长片段的克隆

利用 RT-PCR方法从红巴梨成熟果皮中克隆出花青素生成相关基因 f3 h的全长片段 (1 0 95 bp) .核苷酸序列测定表明 ,该基因与苹果的 f 3 h基因同源性高达 97% .

转cry1Ab/vip3H+epsps基因粳稻对非靶标害虫稻叶蝉田间种群的影响

转基因作物可能带来的风险之一是对非靶标生物尤其是非靶标植食者产生潜在的影响。本研究采用吸虫器取样法,通过在浙江长兴2地点3年的试验评价了新型抗虫/耐除草剂转cry1Ab/vip3H+epsps基因粳稻(G6H1)及其亲本对照(秀水110,XS110)对稻叶蝉田间种群动态的影响。结果表明:叶蝉类主要有黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps(Uhler)、二点叶蝉Cicadula fascifrons(Stl)和电光叶蝉Deltocephalus dorsalis Motschulsky组成,其中黑尾叶蝉是优势种。虽然3种叶蝉的种群密度随着地点和年份的不同有所不同,但是转基因水稻对3种叶蝉种群密度的年度变化均没有显著性影响。少数年份,黑尾叶蝉成虫、若虫及其两者总密度的时间动态在转基因水稻和对照田之间存在差异,大多数年份,趋势一致且无显著差异(P>0.05)。另外,二点叶蝉和电光叶蝉种群的时间动态在转基因水稻和对照田之间也相似。综合评价认为,本供试转基因水稻品系G6H1对稻田稻叶蝉种群无明显的负面影响。

根癌农杆菌介导反义F3'H基因对矮牵牛的遗传转化

以矮牵牛无菌苗叶片作为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系。通过农杆菌介导法将水稻反义类黄酮3'-羟化酶基因(F3'H)转入矮牵牛中,抗性植株经PCR检测均为阳性植株,初步表明反义F3'H基因已整合到矮牵牛基因组中;对阳性植株进行半定量RT-PCR检测,与非转基因植株相比,阳性植株中F3'H基因的表达减弱,表明导入的反义F3'H基因抑制了内源基因的表达。

矮牵牛F3′5′H基因的克隆及其在不同着色花药中的表达

通过品种间杂交和后代筛选,从模式植物矮牵牛中筛选出具有蓝花冠蓝花药的稳定株系。为了明确蓝色花药形成的分子机制,对蓝色花色素苷合成途径中的关键酶黄烷酮3′,5′-羟化酶(F3′5′H)进行研究,比较不同花药着色的矮牵牛植株中,F3′5′H基因组DNA的PCR扩增模式、基因组序列,以及花发育第3阶段的花药组织中基因表达差异。结果表明,蓝色花药植株与对照材料间的F3′5′H基因组DNA扩增模式基本相同,都存在两个基因编码位点Hf1和Hf2。在蓝色花药植株中,Hf1位点扩增出两个片段,一个与已公布的Hf1的序列完全一致,另一个是不能编码完整蛋白的假基因;Hf2基因位点也扩增出两个基因片段,其中有一个片段的5′-末端序列与已公布的Hf2序列有96%同源性,另一个是非特异性扩增产物。此外,Hf1基因可以在花药组织中表达,但仅在蓝色花药中有转录,而Hf2基因在花药组织中没有表达。根据上述结果认为,矮牵牛植株中,编码F3′5′H的Hf1基因与蓝色花药的形成相关,这一结论为进一步揭示矮牵牛蓝色花药形成的分子机制奠定了基础。

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因"F3′5′H"构建新的表达载体,拟以该启动子驱动"F3′5′H"在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550 bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553 bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98.55%。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与"F3′5′H"构建成能够在植物中进行遗传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。

滁菊f3'h基因启动子的克隆及分析

为探明滁菊类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因在类黄酮物质合成过程中的作用,基于本实验室已经获得滁菊f3'h编码基因的基础上,采用Genome Walking技术,克隆了1 348 bp的启动子,序列分析表明,该启动子片段除含有真核生物启动子核心元件TATA-Box等外,还含有参与脱落酸响应(ABRE)元件以及G-Box等参与光响应单元、植物激素响应单元件植物防御和逆境胁迫应答元件、以及环境因素等多个顺式调控元件。该基因启动子的克隆及其初步分析将为深入研究f3'h基因在滁菊类黄酮合成中的分子机制提供参考、为开发滁菊分子育种提供有效基因原件,以及为今后利用生物技术手段提高滁菊黄酮含量奠定基础。

石榴F3’H基因PCR反应体系的研究

从石榴(Punica granatum L.)泰山红品种的花瓣中提取总RNA并反转录得到cDNA。设计简并引物对石榴类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因进行PCR扩增,筛选合适的引物及退火温度。结果表明,适合石榴F3’H基因扩增的正反向引物分别为5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′,5′-TCHCCDGCWATG-GCCCAHAYRTT-3′。PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,54℃退火45 s,72℃延伸60 s,共35个循环;72℃保温10 min。

绿豆C3H和NBS转录因子家族成员鉴定及盐胁迫响应分析

NBS和C_(3)H是植物体内2个重要的转录因子家族,在调控植物抗病与耐盐方面不可或缺。本研究通过转录组数据分析、qRT-PCR分析,分别鉴定出30个和289个绿豆C_(3)H和NBS家族成员,2个基因家族各有13个基因受到纯化选择,并且C_(3)H和NBS基因家族种内共线性关系均为片段重复。耐盐材料的转录组数据分析结果表明,VrC_(3)H5、VrC_(3)H7、VrC_(3)H10和VrC_(3)H13等4个基因的表达量在盐胁迫后发生显著改变。VrC_(3)H5,VrC_(3)H7和VrC_(3)H133个基因对脱落酸(ABA)处理、氯化钠(NaCl)处理、干旱胁迫都有不同程度的响应,VrC_(3)H5在ABA处理后基因表达量上调超过了10倍。在NBS基因中,有85个基因在盐胁迫10 d和15 d后出现显著差异表达,其中9个NBS基因表达变化值|log_(2)FC|(FC为表达倍数变化)大于2。VrNBS20转录因子通过调控EVM0022385参与绿豆的耐盐功能,VrNBS20可能是绿豆抗病与耐盐调控网络中的交叉点。本研究结果为绿豆耐盐与抗病研究提供了丰富的基因资源。