mTOR信号通路在17-DMAG克服EML4-ALK阳性肺癌细胞株H3122对alectinib耐药中的作用机制研究

目的观察m TOR信号通路在17-DMAG克服旁路信号通路激活诱导棘皮动物微管相关蛋白样4与间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因阳性肺癌细胞株H3122(以下简称"H3122细胞")对alectinib耐药中的变化,并探讨其内在的调控机制。方法加入100 ng/m L转化生长因子α(transforming growth factor-α,TGF-α)和100 ng/m L表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导H3122细胞对alectinib耐药,观察加入17-DMAG后上述耐药能否被克服。采用CCK-8法检测不同处理方式下H3122细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测不同处理方式下细胞中ALK、EGFR及其磷酸化蛋白的表达,观察其下游m TOR信号通路关键蛋白及活化水平的表达情况。结果 alectinib作用72 h后H3122细胞增殖率随药物浓度升高而下降,IC50为0.042μmol/L;联合TGF-α或EGF后H3122细胞对alectinib耐药,IC50远大于10μmol/L;单药17-DMAG处理后H3122细胞增殖率随药物浓度升高而下降,IC50为0.245μmol/L;联合TGF-α或EGF后H3122细胞增殖率亦被17-DMAG抑制,且呈剂量依赖性,IC50分别为0.251μmol/L和0.301μmol/L。经0.05μmol/L alectinib作用72 h后H3122细胞凋亡率为(30.01±0.92)%,alectinib联合TGF-α或EGF后细胞凋亡率分别为(6.36±0.14)%和(6.13±0.21)%,显著低于alectinib单药处理(P<0.001);经0.3μmol/L 17-DMAG单药或联合TGF-α、EGF作用72 h后H3122细胞凋亡率分别为(28.37±1.75)%、(26.69±1.2)%和(26.62±0.72)%,差异无统计学意义(P>0.05)。alectinib可抑制H3122细胞中p-ALK、p-m TOR的表达,也可抑制m TOR上、下游关键蛋白的活化状态;EGF可明显增加细胞中p-EGFR、p-m TOR及m TOR上、下游关键蛋白的活化水平表达;alectinib可抑制p-ALK表达,但联合EGF后不能抑制m TOR及m TOR上、下游关键蛋白活化水平的表达;即使联合EGF后,17-DMAG亦能抑制H3122细胞中ALK、EGFR、m TOR信号通路蛋白及其活化状态蛋白的表达。结论旁路信号通路激活介导EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞株H3122对alectinib耐药的方式具有可行性,m TOR信号通路在17-DMAG克服旁路信号通路激活引起alectinib的获得性耐药过程中有一定作用。

转化生长因子β受体Ⅱ在EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌患者肿瘤组织中的表达及其对H3122细胞侵袭力的影响

目的探讨转化生长因子β受体Ⅱ(TGFβRⅡ)在棘皮动物微管相关蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因阳性肺腺癌患者肿瘤组织中的表达及对人EML4-ALK阳性肺腺癌细胞H3122侵袭力的影响。方法纳入EML4-ALK阳性肺腺癌患者18例,其中ⅠA期11例,ⅢA期7例,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测患者肺癌组织中TGFβRⅡmRNA的表达量。构建TGFβRⅡ沉默质粒(TGFβRⅡ-shRNA)及阴性对照(NC-shRNA)质粒,进行慢病毒包装后转染H3122细胞,并将转染TGFβRⅡ-shRNA、NC-shRNA质粒的细胞设为LV-shRNA-TGFβRⅡ-H3122组、LV-shRNA-GP-H3122组,测定两组细胞的侵袭能力。结果ⅠA期与ⅢA期肺腺癌组织的TGFβRⅡmRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0. 05)。LV-shRNA-TGFβRⅡ-H3122组通过Transwell的细胞数多于LV-shRNA-GP-H3122组(P <0. 05)。结论 TGFβRⅡmRNA在早期与中晚期EML4-ALK阳性肺腺癌组织中的表达无明显差异,但沉默TGFβRⅡ基因后EML4-ALK阳性肺腺癌细胞侵袭性明显增强。

克唑替尼对非小细胞肺癌细胞放射增敏作用的研究

目的观察体外环境下克唑替尼对NSCLC细胞的放射增敏效果及其潜在机制。方法以H2228及H3122细胞株为实验对象,MTT法检测不同浓度克唑替尼对NSCLC细胞的抑制作用;平板克隆形成实验分别测定NSCLC细胞在克唑替尼作用下照射以及单纯照射的SF,拟合细胞生存曲线并计算放射增敏比;流式细胞仪检测各细胞株的接受不同剂量放射线后细胞凋亡率及细胞周期分布的变化;Western Blot检测各细胞株接受放射线照射后STAT3及p-STAT3蛋白表达水平变化。结果 MTT实验:抑制率与浓度变化呈正相关。IC50分别为330 n M和102 n M。克隆形成实验:附加药物照射的细胞SF低于单纯照射组。H2228/H3122细胞株组中,SER(D0):1.064/1.004;SER(Dq):1.079/1.047。流式细胞术:两细胞的凋亡率与照射剂量呈正比。在H2228组细胞中G0/G1期细胞阻滞现象明显,H3122细胞各周期细胞比率未见明显变化。Western Blot法:应用克唑替尼联合时STAT3的磷酸化过程受到阻滞。H2228细胞株阻滞现象更为明显。结论克唑替尼对NSCLC H2228及H3122细胞株均有放射增敏作用,对H2228细胞株的放射增敏效果更加明显。