结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA抗结核免疫效应的初步研究

目的:探讨小鼠皮内注射结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,比较研究结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法:用结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠第30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较无明显差异;与生理盐水组比较差异显著(P<0.05)。结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较无明显差异,与未免疫组比较差异显著(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA小鼠皮内接种后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,且该效应与卡介苗菌无明显差异。

卡介苗菌株和结核分枝杆菌H37Ra菌株原生质体的制备研究

分别以卡介苗菌株(BCG)及结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株(H37Ra)为受体菌,制备上述两种菌株的原生质体,同时通过优化细菌菌龄、酶解浓度、酶解温度以及酶解时间等影响因素,探索出制备原生质体形成及再生的最优条件。结果显示:摸索出制备BCG和H37Ra菌株的原生质体条件:在对数生长期的两亲本菌株,经0.01 mol/L EDTA,0.01%β-巯基乙醇溶液预处理;酶解浓度为12 mg/mL,酶解温度为37℃,酶解时间为5 h,可制备出活性较高的两种菌株的原生质体。由此可知,成功制备了BCG与H37Ra菌株的原生质体,并能在高渗固体培养基上再生。本实验为进一步研究该两种菌株原生质体融合试验奠定了基础。

茶叶不同提取物及不同茶叶对结核分枝杆菌抑制作用的研究

为探明茶叶对结核分枝杆菌H_(37)Ra菌株的抑制作用,采用牛津杯法对H_(37)Ra菌株进行抑菌试验,研究不同茶叶提取物(茶多酚、茶多糖和茶皂素)及不同种类茶叶(华农绿针、大宗炒青、广东大叶青、福鼎寿眉、铁观音、凤凰单丛、祁门红茶、下关沱茶、青砖茶)对H_(37)Ra菌株活性的抑制能力。结果显示,茶多酚对H_(37)Ra菌株表现出显著的抑菌能力,随着茶多酚浓度的增加,抑菌效果逐渐增强;在40 mg·m L^(-1)下,茶多酚显示出长期抑制H_(37)Ra菌株生长的能力;茶多糖和茶皂素对结核分枝杆菌没有抑制作用;不同种类茶叶表现出不同程度的抑菌能力,其中凤凰单丛的乙酸乙酯部较其他分离部有更强的抑菌能力,其60%乙醇洗脱的柱层析分离物抑菌能力最强,推测茶多酚是抑制H_(37)Ra菌株生长的主要成分。研究结果证实了茶叶对H_(37)Ra菌株具有抑制作用,且茶叶不同提取物和不同种类茶叶在抑菌能力上存在差异,为开发结核病相关的抗菌药物提供了一个新思路。

pup/mpa/dop/pafA基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv和无毒株H37Ra的构建

目的构建pup/mpa/dop/pafA基因过表达结核杆菌国际标准强毒株H37Rv和无毒株H37Ra。方法提取已构建的结核杆菌-大肠埃希菌重组穿梭质粒PMV361pup,PMV361mpa,PMV361dop和PMV361pafA,利用电转化方法分别转入H37Rv和H37Ra感受态细胞,构建pup/mpa/dop/pafA基因过表达H37Rv和H37Ra,同时优化电转化脉冲电压,并应用QRT-PCR进行检测及鉴定。结果成功构建了pup/mpa/dop/pafA基因过表达H37Rv和H37Ra,重组菌均能表达目的基因,在2 100~2 300V脉冲电压范围内构建的菌株目的基因相对表达量与电压呈正相关。结论构建的pup/mpa/dop/pafA基因过表达H37Rv和H37Ra均能表达相应目的基因,以电压为2 300V电转化构建的菌株表达量较高。

小鼠脾脏IL-35 mRNA表达水平与结核分枝杆菌感染的相关性分析

目的分析小鼠脾脏白细胞介素-35(IL-35)mRNA表达水平与结核分枝杆菌感染的相关性。方法取36只清洁级C57B/L6小鼠,随机分为对照组(正常小鼠)、实验1组(结核分枝杆菌H37Ra菌株感染1个月)、实验2组(结核分枝杆菌H37Ra菌株感染2个月),每组各12只。比较三组小鼠体质量比值、肺部细菌计数及脾脏脏器系数。观察三组小鼠肺组织一般生理状况,经苏木精-伊红染色,行病理检查,并采用实时荧光定量聚合酶链反应检测小鼠脾脏组织中IL-35(P35亚基和EBI3亚基)mRNA相对表达量。结果实验1组和实验2组体质量比值较对照组均明显降低(P<0.01);而实验1组与实验2组体质量比值的比较,并无显著差异(P>0.05)。实验1组和实验2组脾脏脏器系数较对照组均明显升高(P<0.01),且实验2组脾脏脏器系数较实验1组明显升高(P<0.01)。实验2组肺部细菌计数较实验1组明显增多(P<0.01)。相比对照组,实验1组和实验2组肺部标本观察可见其外观出现大小不一、密集的不规则形或圆形的浅黄色或米白色颗粒,且实验2组肺组织的颗粒数量明显增多,可见融合更大的颗粒。经苏木精-伊红染色结果可知,相比对照组,实验1组小鼠肺部结构受破坏明显,可见大量红细胞渗出;相比对照组,实验2组小鼠肺部可见诸多淋巴细胞和中性粒细胞聚集,且可见诸多单个核细胞浸润。经实时荧光定量聚合酶链反应检测结果可知,实验1组和实验2组P35 mRNA和EBI3 mRNA相对表达量较对照组均明显上调(P<0.05),且实验2组P35 mRNA和EBI3 mRNA相对表达量较实验1组均明显上调(P<0.05)。结论小鼠经结核分枝杆菌H37Ra菌株感染后,肺部组织中的IL-35 mRNA表达量显著上调,且其表达上调可能与小鼠结核分枝杆菌感染存在密切关系。