热杀死结核分支杆菌H37Ra诱导的SD大鼠佐剂性关节炎模型研究

目的对热杀死结核分支杆菌H37Ra(Mtb)诱导SD大鼠关节炎模型的血液学、T细胞功能、关节滑膜细胞凋亡及病理变化进行分析,以评价该模型与临床RA类疾病的相似性。方法 SD大鼠尾根部一次性皮下注射Mtb-矿物油诱导剂,定期检测大鼠外周血液常规、血液流变学改变;采用流式细胞术测定外周血淋巴细胞凋亡率及调节性T细胞比例;TUNEL法检测关节滑膜细胞凋亡,镜下观察关节滑膜病理改变。结果 SD大鼠经Mtb免疫后,外周血血红蛋白含量下降,血小板总数、红细胞压积上升,全血黏度、血浆黏度上升;外周血淋巴细胞凋亡率明显降低;CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+T细胞的比例、CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例均下降;关节滑膜细胞凋亡减少;关节滑膜组织异常增生,有大量炎性细胞浸润,并有肉芽组织形成。结论由Mtb诱导的SD大鼠佐剂性关节炎模型临床表现及组织学改变与临床RA相似,免疫学指标存在明显的细胞免疫异常;该模型制作方法简单、复制成功率高、经济实用,可广泛用于RA的医学研究及抗RA新药筛选。

人型结核杆菌H_(37)Rv株菌体特异性抗原TB4单克隆抗体的纯化

采用硫酸铵法、辛酸二步法、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 离子交换柱层析法，从杂交瘤小鼠腹水中纯化人型结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ 株特异性抗原ＴＢ４ 的单克隆抗体，从回收率、纯度和活性３ 个方面进行比较。结果显示，硫酸铵法回收率最高，层析法纯度最高，３ 种方法对单抗的活性均无大的影响。认为：辛酸二步法可有效地去除白蛋白，适用于大量腹水中单抗的提取、纯化，具有简单、省时等优点；

结核杆菌H_(37)Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆及表达

目的 构建在大肠杆菌中高效表达结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶(ICL)的重组质粒,实现ICL在原核表达系统的高效稳定表达。方法 采用PCR和克隆技术构建含有结核杆菌H37TRy ICL基因的表达质粒pET30(a)-Rv0467,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达。目的蛋白经金属螯合层析纯化后,对其活性进行初步研究。结果 构建了高效表达结核杆菌H37Rv ICL的质粒;在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总蛋白含量的30％;表达产物以可溶性形式存在,通过金属螯合层析纯化,所得酶的纯度为90％;目的蛋白具有ICL的活性。结论 利用原核表达系统成功克隆表达了结核杆菌H37Rv的ICL,为以ICL为靶点建立新型抗结核药物奠定了基础。

结核分枝杆菌H37Rv ORF的高通量克隆和表达方法的建立

以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,采用Gateway重组表达系统,以基因长度200～2500 bp为标准,选择目的基因（n=384）,以ORF的保守序列设计引物并加上正反向AttB,通过PCR扩增获得基因片段检测入门克隆,得到的克隆有效率为374/384。通过两次同源重组,这些基因片段被克隆到表达载体中,克隆效率为350/384。随后将这些重组表达质粒分别在2个表达菌株BL21和BL21-codonplus-RP中进行诱导表达,表达得率为270/384,并对其中64个进行了纯化,16个是可溶性表达。这种大规模高效率地克隆表达技术适合各种生物的开放阅读框的克隆表达,是一种高通量的克隆表达方法。

结核分枝杆菌H37Rv蛋白Rv2364c的表达纯化与生物信息学分析

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌H37Rv的Rv2364c蛋白,为研发抗结核分枝杆菌的药物提供材料。方法 PCR扩增目的基因Rv2364c。将PCR产物克隆至原核表达载体p ET-28a中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-Rv2364c。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。表达产物经镍亲和层析柱纯化,并对该蛋白做生物信息分析。结果双酶切和基因测序结果表明,成功构建了含有Rv2364c基因的重组表达质粒。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白在大肠杆菌中得到了大量表达,经镍亲和层析柱纯化后目的蛋白的纯度达到了90%以上。生物信息学分析表明Rv2364c为稳定酸性蛋白,α-螺旋和无规卷曲为其主要二级结构元件,主要结构域类型有Era结构域和KH结构域两种。结论成功表达和纯化了Rv2364c蛋白,并利用生物信息学方法初步预测其结构域等,为进一步研究Rv2364c在结核病发生发展中的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。

结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突变株的构建与鉴定

目的构建及鉴定结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株。方法体外培养结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株,并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列,分别插入到pKO质粒载体预定位点中,构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,电转入结核分枝杆菌H37Rv菌株内,并与其基因组中的Hsp16.3基因同源交换,筛选出Hsp16.3基因缺失突变株。结果通过卡那霉素筛选和蔗糖反筛选及PCR鉴定,并在含有潮霉素培养基上不能生长的菌株为Hsp16.3基因缺失突变株。结论成功构建出结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株。

结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞的研究

目的:研究结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后氮氧化物的产生及细胞因子的分泌和表达情况。方法:结核杆菌H37Ra感染RAW264.7巨噬细胞株24 h后收集上清液,用Griess法检测一氧化氮(NO),化学法检测过氧化氢(H2O2)的产生,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测感染后巨噬细胞IL-12和TNF-αmRNA的表达,ELISA法检测细胞因子IL-12和TNF-α的含量。结果:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后产生的NO和H2O2水平均显著升高,同时IL-12和TNF-α的分泌和表达也明显增加(P<0.05)。结论:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后能产生大量的氮氧化物和抗结核细胞因子,从而产生有利于宿主的抗结核免疫应答。

结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA抗结核免疫效应的初步研究

目的:探讨小鼠皮内注射结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,比较研究结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法:用结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠第30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较无明显差异;与生理盐水组比较差异显著(P<0.05)。结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较无明显差异,与未免疫组比较差异显著(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA小鼠皮内接种后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,且该效应与卡介苗菌无明显差异。

结核分枝杆菌H37Ra抗结核作用相关研究进展

结核分枝杆菌H37Ra菌株(H37Ra)是人型结核分枝杆菌减毒株,它毒力极弱,对宿主相对安全,具备活菌疫苗的条件。与卡介苗(BCG)相比H37Ra菌株具有更完整的免疫原性,并包含一些BCG中丢失的抗原性成分。同时,H37Ra菌株能够充分活化巨噬细胞,刺激机体产生特异性免疫应答,在防治结核病中起到重要作用。因此,H37Ra菌株对机体抗结核的保护作用是否强于BCG,是否能作为抗结核的候选活疫苗已受到学者的关注,为今后研制新型、安全、高效的结核病苗奠定基础。本文对H37Ra菌株抗结核的相关研究进行了综述。

淋巴结核丸对H37Rv、耐多药结核菌体外药敏实验研究

目的:淋巴结核丸对强毒人型结核菌(H37Rv)及耐多药结核菌(mutiple drugs resistant Bacillus tuberculosis,MDR-TB)在体外药敏实验。方法:用美国B-D公司生产试剂12B培养液和Bectec-460检测仪检测。结果:实验表明淋巴结核丸对H37Rv具有抑制作用,最低抑菌浓度为22.5mg/ml;对MDR-TB具有显著的抗菌作用P<0.01,最低抗菌浓度为22.5mg/ml,而对照药异烟肼、利福平、乙胺丁醇无抑菌作用。结论:用淋巴结核丸对H37Rv、MDR-TB均具有抑菌作用。

人型结核分枝杆菌H37Ra在构建实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型中的应用

目的探讨人型结核分枝杆菌H37Ra在以鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段(R97-116)为免疫原构建重症肌无力动物模型实验中的作用。方法以R97-116为免疫原于Lewis大鼠皮下及足垫进行皮下接种,以是否添加H37Ra为条件将20只动物分为实验组和对照组,同时设置空白对照组(10只)。比较各组间行为学、体重及乙酰胆碱受体抗体滴度差异。结果实验组动物局部炎性反应明显,3只动物死亡,6只出现无力症状,1只未出现明显异常表现,6只有无力症状大鼠抗体均呈阳性。对照组大鼠接种处也有局部炎性反应,仅有2只出现轻度无力症状,其中1只抗体可疑阳性,另1只阴性。实验组大鼠体重[(190. 21±8. 35) g]明显低于对照组[(243. 22±7. 98) g]和空白对照组[(251. 22±5. 81) g],差异有统计学意义(P <0. 05),对照组和空白对照组差异无统计学意义。结论 H37Ra为本实验成功的必要试剂。

蛋白质组学发现结核分枝杆菌H37Rv基因组学未预测的开放阅读框架

每年结核病的新发病例为800万,病死人数200万,世界卫生组织宣布全球结核病处于紧急状态,亟需预防和治疗结核病的新策略。蛋白质组学反映细胞对环境刺激的功能状态,因此它可作为基因组学有价值的补充。为了寻找免疫干预的新策略,通过比较结核分枝杆菌(MTB)有毒株与无毒疫苗株之间蛋白质组成的差异进行系统蛋白质组的研究。

结核分支杆菌Rv0901基因置换型打靶载体的构建

目的 :对结核杆菌H3 7Rv的Rv0 90 1基因进行体外扩增 ,构建基因打靶载体 ,利用基因打靶技术进行结核分支杆菌基因Rv0 90 1功能的研究。方法 :结核分支杆菌标准毒力株H3 7Rv体外培养 ,扩增目的基因 ,连接载体及目的片段 ,切除目的基因 ,筛选阳性克隆 ,酶切鉴定。结果 :经酶切鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符 ,鉴定证实PCR产物及插入片段为所需目的基因片段 ,成功切除靶片段。证实标记基因插入片段插入方向正确。结论 :成功构建了用于结核分支杆菌基因打靶的置换型载体 ,为随后将进行的Rv0 90 1基因敲除株的建立 ,Rv0 90 1基因功能的研究奠定了基础。

人型结核杆菌H_(37)Ra的抗原决定簇的筛选及其初步鉴定

本文报道一种筛选人型结核杆菌H_(37)Ra的抗原决定簇的Western Blot分析技术。细菌培养于Sauton培养基,于低温超声波粉碎后以15％SDS-PAGE进行蛋白质电泳分离,然后电转移至硝酸纤维素薄膜上,应用鼠抗人型结核杆菌单克隆抗体进行免疫检测。通过免疫印染,一条能与单克隆抗体起强阳性反应的蛋白带被识别。应用蛋白质洗脱技术,获得这个含有抗原决定簇的蛋白质片段。经过电泳分析,该蛋白质片段分子量为35,000道尔顿,斑点免疫试验证实该片段具有生物学活性,并对该片段进行了氨基酸组成的分析。本文提示,应用Western Blot分析技术是筛选抗原决定簇的有效方法,值得推荐。

人型结核杆菌H37Ra的抗原决定簇的筛选及其初步鉴定

本文报道一种筛选人型结核杆菌H37Ra的抗原决定簇的Western Blot分析技术。细菌培养滤液经15％SDS—PAGE电泳进行分离,然后电转移到硝酸纤维素薄膜上,应用鼠抗人结核杆菌单克隆抗体进行免疫反应。通过免疫印染,一条能与McAb起强阳性反应的蛋白带被识别。应用蛋白质洗脱技术,这个蛋白质片段被提纯。经SDS—PAGE电泳分析,这个含有抗原决定簇的蛋白质片段为分子量17,500道尔顿,斑点免疫试验证实该片段具有生物学活性。本文提示,Western Blot分析技术是对抗原决定簇进行分析的有用方法,值得推荐。

结核分支杆菌Rv3117基因的克隆与原核表达

以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGEX-4T-1原核表达载体,并将纯化的Rv3117基因亚克隆至pGEX-4T-1中,构建出原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3117。将pGEX-4T-1-Rv3117重组质粒转化至感受态E.coli BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30ku目的蛋白带。Western blot分析结果显示,该蛋白能与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。研究结果为结核病临床诊断抗原的筛选奠定了基础。

H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核模型的研究

目的探索利用H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核病理模型的方法。方法对经过福氏佐剂免疫和致敏的豚鼠,行膝关节腔H37Rv菌株两种菌量(1×107/mL,50μL及100μL)的注射感染,观察豚鼠感染结核菌后膝关节滑膜组织及关节软骨与骨的病理变化,并行膝关节滑膜集菌培养。结果豚鼠膝关节在行两种菌量的H37Rv菌株感染后,局部肿胀均较明显,但动物的全身反应都较轻微。两组动物的膝关节滑膜病理切片均显示有典型的结核结节及其内的干酪样坏死灶形成;切片抗酸染色均检出有抗酸染色阳性的分枝杆菌;两组动物的关节滑膜匀浆培养均有结核分枝杆菌生长。结论通过在经预先免疫与致敏豚鼠的膝关节局部进行适当剂量的H37Rv结核菌株的注射感染,可以构建出与人类滑膜结核病理变化相似的豚鼠膝关节滑膜结核。