结核分枝杆菌H37Rv ORF的高通量克隆和表达方法的建立

以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,采用Gateway重组表达系统,以基因长度200～2500 bp为标准,选择目的基因（n=384）,以ORF的保守序列设计引物并加上正反向AttB,通过PCR扩增获得基因片段检测入门克隆,得到的克隆有效率为374/384。通过两次同源重组,这些基因片段被克隆到表达载体中,克隆效率为350/384。随后将这些重组表达质粒分别在2个表达菌株BL21和BL21-codonplus-RP中进行诱导表达,表达得率为270/384,并对其中64个进行了纯化,16个是可溶性表达。这种大规模高效率地克隆表达技术适合各种生物的开放阅读框的克隆表达,是一种高通量的克隆表达方法。

结核分枝杆菌H37Rv蛋白Rv2364c的表达纯化与生物信息学分析

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌H37Rv的Rv2364c蛋白,为研发抗结核分枝杆菌的药物提供材料。方法 PCR扩增目的基因Rv2364c。将PCR产物克隆至原核表达载体p ET-28a中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-Rv2364c。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。表达产物经镍亲和层析柱纯化,并对该蛋白做生物信息分析。结果双酶切和基因测序结果表明,成功构建了含有Rv2364c基因的重组表达质粒。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白在大肠杆菌中得到了大量表达,经镍亲和层析柱纯化后目的蛋白的纯度达到了90%以上。生物信息学分析表明Rv2364c为稳定酸性蛋白,α-螺旋和无规卷曲为其主要二级结构元件,主要结构域类型有Era结构域和KH结构域两种。结论成功表达和纯化了Rv2364c蛋白,并利用生物信息学方法初步预测其结构域等,为进一步研究Rv2364c在结核病发生发展中的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。

结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突变株的构建与鉴定

目的构建及鉴定结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株。方法体外培养结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株,并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列,分别插入到pKO质粒载体预定位点中,构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,电转入结核分枝杆菌H37Rv菌株内,并与其基因组中的Hsp16.3基因同源交换,筛选出Hsp16.3基因缺失突变株。结果通过卡那霉素筛选和蔗糖反筛选及PCR鉴定,并在含有潮霉素培养基上不能生长的菌株为Hsp16.3基因缺失突变株。结论成功构建出结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株。

结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA抗结核免疫效应的初步研究

目的:探讨小鼠皮内注射结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,比较研究结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法:用结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠第30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较无明显差异;与生理盐水组比较差异显著(P<0.05)。结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较无明显差异,与未免疫组比较差异显著(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA小鼠皮内接种后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,且该效应与卡介苗菌无明显差异。

结核分枝杆菌H37Ra抗结核作用相关研究进展

结核分枝杆菌H37Ra菌株(H37Ra)是人型结核分枝杆菌减毒株,它毒力极弱,对宿主相对安全,具备活菌疫苗的条件。与卡介苗(BCG)相比H37Ra菌株具有更完整的免疫原性,并包含一些BCG中丢失的抗原性成分。同时,H37Ra菌株能够充分活化巨噬细胞,刺激机体产生特异性免疫应答,在防治结核病中起到重要作用。因此,H37Ra菌株对机体抗结核的保护作用是否强于BCG,是否能作为抗结核的候选活疫苗已受到学者的关注,为今后研制新型、安全、高效的结核病苗奠定基础。本文对H37Ra菌株抗结核的相关研究进行了综述。

卡介苗菌株和结核分枝杆菌H37Ra菌株原生质体的制备研究

分别以卡介苗菌株(BCG)及结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株(H37Ra)为受体菌,制备上述两种菌株的原生质体,同时通过优化细菌菌龄、酶解浓度、酶解温度以及酶解时间等影响因素,探索出制备原生质体形成及再生的最优条件。结果显示:摸索出制备BCG和H37Ra菌株的原生质体条件:在对数生长期的两亲本菌株,经0.01 mol/L EDTA,0.01%β-巯基乙醇溶液预处理;酶解浓度为12 mg/mL,酶解温度为37℃,酶解时间为5 h,可制备出活性较高的两种菌株的原生质体。由此可知,成功制备了BCG与H37Ra菌株的原生质体,并能在高渗固体培养基上再生。本实验为进一步研究该两种菌株原生质体融合试验奠定了基础。

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的:克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10(CFP10)基因,并对其进行序列分析。方法:自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFP10基因设计引物。通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果:PCR产物电泳显示扩增片段约为300 bp,测序获得的片段开放编码框由303 bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100%,推导出编码氨基酸序列同源性为100%。结论:成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFP10基因序列无差异。

结核分枝杆菌H37Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。

蛋白质组学发现结核分枝杆菌H37Rv基因组学未预测的开放阅读框架

每年结核病的新发病例为800万,病死人数200万,世界卫生组织宣布全球结核病处于紧急状态,亟需预防和治疗结核病的新策略。蛋白质组学反映细胞对环境刺激的功能状态,因此它可作为基因组学有价值的补充。为了寻找免疫干预的新策略,通过比较结核分枝杆菌(MTB)有毒株与无毒疫苗株之间蛋白质组成的差异进行系统蛋白质组的研究。

结核分枝杆菌H37Ra菌株感染小鼠脾组织IL-35 mRNA表达及其意义

目的:探讨H37Ra菌株感染后小鼠脾脏IL-35 mRNA的表达情况,分析其在结核分枝杆菌(M.tb)感染中的作用与意义。方法:将清洁级C57B/L6小鼠分为对照组、感染4周组和感染8周组,每组10只。采用H37Ra菌株感染后,观察小鼠一般状况与肺组织病理,并检测肺部感染细菌数及脾组织IL-35的mRNA表达水平。结果:H37Ra菌株感染小鼠在不同时段其脾组织IL-35(EBI3亚基和P35亚基)的mRNA表达均高于对照组(P<0.01),感染8周组的脾组织IL-35的mRNA表达水平更高(P<0.01)。结论:结核分枝杆菌H37Ra菌株感染小鼠后脾组织IL-35 mRNA表达水平升高,IL-35表达可能与结核分枝杆菌感染密切相关。

茶叶不同提取物及不同茶叶对结核分枝杆菌抑制作用的研究

为探明茶叶对结核分枝杆菌H_(37)Ra菌株的抑制作用,采用牛津杯法对H_(37)Ra菌株进行抑菌试验,研究不同茶叶提取物(茶多酚、茶多糖和茶皂素)及不同种类茶叶(华农绿针、大宗炒青、广东大叶青、福鼎寿眉、铁观音、凤凰单丛、祁门红茶、下关沱茶、青砖茶)对H_(37)Ra菌株活性的抑制能力。结果显示,茶多酚对H_(37)Ra菌株表现出显著的抑菌能力,随着茶多酚浓度的增加,抑菌效果逐渐增强;在40 mg·m L^(-1)下,茶多酚显示出长期抑制H_(37)Ra菌株生长的能力;茶多糖和茶皂素对结核分枝杆菌没有抑制作用;不同种类茶叶表现出不同程度的抑菌能力,其中凤凰单丛的乙酸乙酯部较其他分离部有更强的抑菌能力,其60%乙醇洗脱的柱层析分离物抑菌能力最强,推测茶多酚是抑制H_(37)Ra菌株生长的主要成分。研究结果证实了茶叶对H_(37)Ra菌株具有抑制作用,且茶叶不同提取物和不同种类茶叶在抑菌能力上存在差异,为开发结核病相关的抗菌药物提供了一个新思路。

人型结核杆菌H_(37)Rv株菌体特异性抗原TB4单克隆抗体的纯化

采用硫酸铵法、辛酸二步法、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 离子交换柱层析法，从杂交瘤小鼠腹水中纯化人型结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ 株特异性抗原ＴＢ４ 的单克隆抗体，从回收率、纯度和活性３ 个方面进行比较。结果显示，硫酸铵法回收率最高，层析法纯度最高，３ 种方法对单抗的活性均无大的影响。认为：辛酸二步法可有效地去除白蛋白，适用于大量腹水中单抗的提取、纯化，具有简单、省时等优点；

结核杆菌H_(37)Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆及表达

目的 构建在大肠杆菌中高效表达结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶(ICL)的重组质粒,实现ICL在原核表达系统的高效稳定表达。方法 采用PCR和克隆技术构建含有结核杆菌H37TRy ICL基因的表达质粒pET30(a)-Rv0467,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达。目的蛋白经金属螯合层析纯化后,对其活性进行初步研究。结果 构建了高效表达结核杆菌H37Rv ICL的质粒;在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总蛋白含量的30％;表达产物以可溶性形式存在,通过金属螯合层析纯化,所得酶的纯度为90％;目的蛋白具有ICL的活性。结论 利用原核表达系统成功克隆表达了结核杆菌H37Rv的ICL,为以ICL为靶点建立新型抗结核药物奠定了基础。

H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核模型的研究

目的探索利用H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核病理模型的方法。方法对经过福氏佐剂免疫和致敏的豚鼠,行膝关节腔H37Rv菌株两种菌量(1×107/mL,50μL及100μL)的注射感染,观察豚鼠感染结核菌后膝关节滑膜组织及关节软骨与骨的病理变化,并行膝关节滑膜集菌培养。结果豚鼠膝关节在行两种菌量的H37Rv菌株感染后,局部肿胀均较明显,但动物的全身反应都较轻微。两组动物的膝关节滑膜病理切片均显示有典型的结核结节及其内的干酪样坏死灶形成;切片抗酸染色均检出有抗酸染色阳性的分枝杆菌;两组动物的关节滑膜匀浆培养均有结核分枝杆菌生长。结论通过在经预先免疫与致敏豚鼠的膝关节局部进行适当剂量的H37Rv结核菌株的注射感染,可以构建出与人类滑膜结核病理变化相似的豚鼠膝关节滑膜结核。

结核分枝杆菌Rv0357c蛋白的生物信息学分析与鉴定

为鉴定结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Rv0357c蛋白的生物学功能,进而寻找新的抗Mtb靶点,对Rv0357c进行生物信息学分析,构建了表达Rv0357c的原核表达载体pET-Rv0357c,并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达Rv0357c融合蛋白,最后用Co 2+亲和层析纯化并对其进行鉴定与活性分析。生物信息学分析表明:Rv0357c是稳定的酸性亲水蛋白,且含有腺苷酸琥珀酸合成酶(AdSS)的2个保守基序和保守的活性位点,同时和人AdSS同工酶(AdSS1和AdSS2)的同源性均低于40%。SDS-PAGE分析证实Rv0357c融合蛋白以包涵体形式表达,亚基分子质量约为48 ku,经包涵体溶解、亲和纯化和重折叠,可以得到可溶性目的蛋白(复性率约为63%)。Western Blot检测进一步表明过表达的蛋白为目的蛋白。此外,酶活性测定证实重折叠的Rv0357c融合蛋白有AdSS活性,比活力为0.0161 U/mg。综上,Rv0357c是功能性的AdSS蛋白,这将为Rv0357c的进一步功能鉴定和开发新型抗Mtb靶点奠定基础。

结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞的研究

目的:研究结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后氮氧化物的产生及细胞因子的分泌和表达情况。方法:结核杆菌H37Ra感染RAW264.7巨噬细胞株24 h后收集上清液,用Griess法检测一氧化氮(NO),化学法检测过氧化氢(H2O2)的产生,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测感染后巨噬细胞IL-12和TNF-αmRNA的表达,ELISA法检测细胞因子IL-12和TNF-α的含量。结果:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后产生的NO和H2O2水平均显著升高,同时IL-12和TNF-α的分泌和表达也明显增加(P<0.05)。结论:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后能产生大量的氮氧化物和抗结核细胞因子,从而产生有利于宿主的抗结核免疫应答。