组蛋白去甲基化酶KDM5A调控H3K4me3参与神经管畸形发生的分子机制

神经管畸形(NTDs)的病因与防治是出生缺陷领域研究的重点,叶酸可以预防神经管畸形但其机制不明。本文借助低叶酸细胞模型和低叶酸NTDs小鼠模型通过染色质免疫共沉淀、Cut&Tag等技术,探讨了组蛋白去甲基化酶lysine demethylase 5A(KDM5A)及其调控的下游组蛋白H3K4me3修饰在叶酸缺乏导致的NTDs发生中的潜在分子机制。结果显示,低叶酸的细胞模型中,qRT-PCR、Western印迹结果显示,KDM5A分子表达明显下降(P<0.05)。作为组蛋白H3K4me3调控的上游关键酶,进一步通过染色质免疫共沉淀ChIP、ChIP-qPCR实验证实,叶酸缺乏下组蛋白H3K4me3在神经发育基因Axin 2和Atoh 1基因启动子区富集增加(P<0.05)。通过构建KDM5A基因敲除细胞模型,借助Cut&Tag试验证实,KDM5A基因敲除后H3K4me3主要富集在神经发育基因上。最后在低叶酸导致的NTDs小鼠模型的脑组织中,RT-qPCR、Western印迹以及ChIP-qPCR实验显示,E9.5 d的NTDs胎鼠脑组织中KDM5A表达下降(P<0.05),Axin2、Atoh1表达升高(P<0.05),Axin2、Atoh 1基因启动子区的H3K4me3富集增多(P<0.05)。综上所述,KDM5A蛋白在叶酸缺乏导致的NTDs中发挥重要作用,其可通过调控下游H3K4me3进而调控神经发育靶基因Axin2、Atoh 1异常表达,介导NTDs的发生。本研究从叶酸缺乏介导KDM5A调控组蛋白修饰来探讨NTDs的发病机制,为降低出生缺陷,促进生殖健康提供依据。

组蛋白H3K27去甲基化酶与肿瘤发生

组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,在基因表达调节方面发挥着重要的作用.组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)是一种抑制性组蛋白标记,可被去甲基化酶UTX和JMJD3催化而移去甲基.UTX和JMJD3通过激活HOX基因而参与细胞分化和多能细胞抑制过程.在多种肿瘤中检测到UTX和JMJD3突变或表达下降,同时多种基因启动子区H3K27me3含量增多.UTX和JMJD3均被看作肿瘤抑制基因,其中UTX调节了RB依赖的细胞命运控制,而JMJD3通过激活INK4b-ARF-INK4a位点而参与了癌基因诱导的衰老.组蛋白H3K27去甲基化酶与肿瘤发生的研究使我们对癌症发展过程有了更好的理解,同时也为癌症诊断和治疗提供了新靶点.

NSD3促进组蛋白H3K36双甲基化抑制巨噬细胞中TNF-α的产生

目的主要研究巨噬细胞中核受体结合SET结构域蛋白3(NSD3)对脂多糖(LPS)触发的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的调控作用,并探讨其调控机制。方法以小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264. 7细胞作为细胞模型。100 ng/m L LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞,采用实时定量PCR检测NSD3 mRNA水平,Western blot法检测NSD3蛋白水平;在RAW264. 7细胞中过表达NSD3或采用RNA干扰技术敲低腹腔巨噬细胞中NSD3的表达,ELISA检测NSD3对LPS触发的TNF-α分泌的影响; Western blot法检测敲低NSD3对LPS触发的核因子κB p65(NF-κBp65)信号通路的影响;荧光素酶法检测NSD3对NF-κBp65介导的TNF-α基因转录活性的影响;染色质免疫沉淀实验检测TNF-α基因启动子区组蛋白H3的36位赖氨酸(H3K36)甲基化的募集。结果 LPS抑制巨噬细胞中NSD3的表达;过表达NSD3抑制LPS触发的TNF-α的产生,敲低NSD3则促进LPS触发的TNF-α的产生,但对NF-κB活化无影响; NSD3抑制NF-κBp65介导的TNF-α基因的转录活化,促进TNF-α基因启动子区的H3K36二甲基化。结论 NSD3促进TNF-α基因启动子区H3K36的双甲基化,抑制TNF-α的表达。

组蛋白去甲基化酶LSD1去除亲代组蛋白H3K4me2促进复制偶联的核小体装配

目的探索真核细胞内影响与调控复制偶联的核小体组装及解聚的表观遗传学机制。方法人骨肉瘤细胞系(U2OS)转染对照和组蛋白H3K4去甲基化酶(lysine-specific demethylase 1,LSD1)siRNA,双胸苷阻滞或胸苷-诺考达唑联合阻滞同步化细胞,释放后在不同时间点进行流式细胞术分析,检测LSD1敲低对细胞周期的影响;免疫印迹试验检测LSD1 siRNA敲低效率;U2OS细胞同步化后进行免疫荧光共聚焦显微镜观察,检测LSD1、组蛋白H3K4二甲基化、一甲基化(H3K4me2/1)在细胞周期中的表达水平;U2OS细胞转染对照、LSD1 siRNA后进行微球菌核酸酶(micrococcal nuclease,MNase)消化后检测核小体装配效率;免疫共沉淀实验检测与LSD1存在相互作用的体内蛋白。结果组蛋白H3K4去甲基化酶LSD1能促进复制偶联的核小体装配。结论复制前期LSD1催化亲代组蛋白H3K4me2去甲基化,导致H3K4me2被清除至一定水平,有助于复制偶联的核小体装配。本研究不仅揭示了LSD1之前未被阐明的生物学功能,同时拓宽了对表观遗传生物学功能的认知。

组蛋白H3K27去甲基化酶UTX在肿瘤研究中的作用

组蛋白去甲基化酶在肿瘤的发生、发展中扮演重要的角色。到目前为止,发现2类,一类是单胺氧化酶,如组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（LSD）1〔1〕;另一类是需要铁离子和α-酮戊二酸参与反应的Jmj C结构域,如UTX和JMJD3,其标准名称分别为KDM6A和KDM6B,能特异性靶向组蛋白H3赖氨酸27位点二、三甲基化（H3K27me2/3）,使组蛋白去甲基化,

NSD2及H3K36甲基化在小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化中的表达

目的在体外建立小鼠胚胎干细胞(m ESCs)向神经细胞(NCs)方向分化体系,观察组蛋白甲基化转移酶NSD2及其相关的组蛋白修饰H3K36二甲基化(H3K36me2)、H3K36三甲基化(H3K36me3)在NCs发育过程中的表达变化。方法用维甲酸(RA)诱导m ESCs向NCs方向分化,通过观察细胞形态和RT-q PCR检测分子标志物来验证m ESCs诱导分化效果,用Western Blot方法检测NSD2以及其相关的组蛋白甲基化修饰在诱导分化过程中的蛋白水平变化。结果与m ESCs状态相比,在m ESCs向NCs方向分化的过程中,NSD2蛋白表现出先升高后下降的变化,差异具有统计学意义(均P<0.05),而其相关的组蛋白甲基化标记H3K36me2和H3K36me3蛋白表达总体变化不大,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ESCs向NCs分化过程中NSD蛋白表达量的改变与相关组蛋白修饰变化趋势不完全一致,组蛋白甲基化修饰总量的变化比较小,这可能是因为同时受到其他甲基化转移酶与去甲基化酶综合作用的结果。

组蛋白H3K27甲基化对人高分化鼻咽癌细胞系CNE-1增殖的抑制效应

目的分析特异性阻断组蛋白H3K27me3/2去甲基化反应对人高分化鼻咽癌CNE-1细胞增殖能力的调控作用及其分子机制。方法体外培养人鼻咽癌细胞系CNE-1,运用组蛋白H3K27me3/2去甲基化酶抑制剂GSK-J4特异性阻断组蛋白H3K27me3/2去甲基化反应。用含0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L的GSK-J4培养基(10%FBS的RPMI-1640培养液)作用于CNE-1细胞作为实验组,同时设溶剂对照(DMSO,二甲基亚砜)。激光共聚焦技术和流式细胞计量术分析细胞内组蛋白H3K27me3的表达水平;实时荧光定量PCR技术检测细胞内cyclinD1和Ki-67 mRNA的表达水平;用CCK-8法检测细胞的增殖活性;平板集落实验检测细胞集落形成能力;流式细胞计量术检测细胞周期的分布。结果实验组细胞内组蛋白H3K27me3表达水平较对照组明显增高(P<0.05);实验组细胞内cyclinD1和Ki-67 mRNA表达水平较对照组明显下调(P<0.05);CNE-1细胞活力随GSK-J4作用浓度的增加逐渐降低,呈浓度依赖性;实验组细胞增殖活力和集落形成能力较对照组明显下降(P<0.05);实验组G0/G1期细胞百分数较对照组增多,S期减少(P<0.05)。结论上调CNE-1细胞内组蛋白H3K27的甲基化修饰水平可以诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,作用机制可能与下调cyclinD1和Ki-67 mRNA水平相关。

组蛋白H3K36位点甲基转移酶识别组蛋白底物的分子机制研究进展

组蛋白H3第36位赖氨酸的甲基化修饰在染色质上含量丰富,与活跃转录以及DNA损伤修复等重要生理过程相关.H3K36位点可以被一甲基化、二甲基化和三甲基化3种形式修饰,目前已知的负责组蛋白H3K36三甲基化修饰的人源蛋白是SETD2,负责组蛋白H3K36二甲基化修饰的酶包含NSD1、NSD2和NSD3和ASH1L共4名成员.这些H3K36甲基转移酶都具有非常特异的H3K36位点选择性,因此,对调控体内H3K36甲基化修饰的水平和分布十分重要.此外,它们的表达异常与人类的多种疾病相关.因此,解析组蛋白H3K36甲基转移酶识别并修饰组蛋白底物的分子机制,对揭示这些酶参与的表观遗传调控机制及其在体内的生理功能都具有十分重要的意义.早期的研究使得人们对组蛋白H3K36甲基转移酶催化底物的机制有了较深入的认识,但是由于解析的修饰酶与底物复合物的结构较少,对这些酶特异识别组蛋白底物分子机制的认识尚有很多不足.近年来,随着冷冻电镜技术的应用,H3K36甲基转移酶与核小体底物的复合物结构相继取得了突破,极大地推进了人们对这些酶识别并催化组蛋白底物分子机制的认识.本文以这几个组蛋白H3K36甲基转移酶为主要目标,对其分子机制的最新进展进行介绍总结.

SETD2调控组蛋白甲基转移酶H3K36me3的分子机制及其与肿瘤的关系

SETD2蛋白主要参与组蛋白甲基化修饰,是迄今已知的人体组织中唯一参与调节组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化(H3K36me3)过程的分子。SETD2基因在许多人类肿瘤组织中存在异常表达,其突变与肿瘤发生、发展和预后相关。该文旨在总结SETD2调控H3K36me3分子机制及其与肿瘤的关系,为后续基于SETD2或H3K36me3靶点的抗肿瘤治疗提供理论基础。

组蛋白H3K9甲基修饰酶在2周、4周和6周龄小鼠肝脏中的表达

目的探讨不同周龄小鼠肝脏组蛋白H3K9甲基转移酶(KMT)和去甲基化酶(KDM)的表达。方法取2周、4周和6周龄BALB/c雄性小鼠肝脏组织,分别提取总mRNA和蛋白质,应用实时定量反转录-聚合酶链式反应(RT-qPCR)确定几种H3K9甲基转移酶和去甲基化酶的表达差异,使用Western blotting检测两种H3K9去甲基化酶KDM3A和KDM4B的蛋白含量。结果几种H3K9甲基转移酶(包括KMT1C、KMT1E和PRDM2)和去甲基化酶(包括KDM3A、KDM3B、KDM4A和KDM4B)的mRNA在小鼠不同年龄阶段的表达存在差异(P<0.05,每年龄段5只小鼠),而两种组蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM4B在蛋白水平也有明显不同,6周龄小鼠肝脏中两种蛋白表达明显低于2周和4周(P<0.05,每年龄段5只小鼠)。结论特定基因位点的H3K9甲基化状态与肝脏发育和生物学功能可能存在密切联系。

H3K36me3及其表观遗传修饰蛋白质SETD2和KDM4B在结直肠癌中的临床病理意义

目的:组蛋白修饰是表观遗传调控的一种重要形式。其中,组蛋白甲基化是染色质状态的关键决定因素。组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化产物(histone H3 trimethylation at lysine 36,H3K36me3)可以介导多种转录相关事件,有助于DNA损伤修复。组蛋白赖氨酸三甲基转移酶SET结构域2(SET domain containing 2,SETD2)、赖氨酸特异性去甲基化酶4B(lysine-specific demethylase 4B,KDM4B)分别是H3K36me3甲基转移酶及去甲基酶,SETD2失活及KDM4B活化均可下调H3K36me3水平从而促进肿瘤的发生和发展。本研究主要探讨H3K36me3、SETD2、KDM4B在结直肠癌中表达的临床病理意义。方法:收集2018年10月至2020年10月就诊于福建中医药大学附属人民医院的80例结直肠癌患者术后石蜡包埋的组织样本。采用免疫组织化学染色法检测H3K36me3、KDM4B、SETD2及4种错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白质(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)在结直肠癌及正常肠黏膜中的表达水平。采用多重荧光PCR-毛细管电泳检测结直肠癌及正常肠黏膜的微卫星状态,分为微卫星高度不稳定性(microsatellite instability-high,MSI-H)组与微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)组,检测2组结直肠癌中H3K36me3及SETD2、KDM4B、MMR蛋白质表达情况并分析其临床病理意义。结果:STED2、H3K36me3表达与结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.745,P<0.001;r=-0.160,P<0.05),KDM4B表达与结直肠癌发生呈正相关(r=0.660,P<0.001)。不同的患者性别、年龄,不同的肿瘤发生部位、大体类型、肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移的临床病理参数之间SETD2及H3K36me的表达差异均无统计学意义(均P>0.05),除在不同的肿瘤浸润深度KDM4B的表达差异有统计学意义(χ^(2)=0.349,P<0.05)外,在其他临床病理参数上KDM4B的表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。结直肠癌样本中检测出14例为MSI-H结直肠癌、66例为MSS结直肠癌;SETD2及H3K36me3的表达均与结直肠癌微卫星状态相关(分别为χ^(2)=3.916,P<0.05及χ^(2)=41.608,P<0.001);KDM4B的表达与结直肠癌微卫星状态无明显相关性(χ^(2)=0.067,P>0.05)。SETD2及H3K36me3表达与MSI-H结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.221,P<0.05及r=-0.721,P<0.001)。KDM4B表达与MSS结直肠癌发生呈正相关(r=0.200,P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示13例(16.25%)为dMMR,67例(83.75%)为pMMR;PCR-毛细管电泳验证结果显示14例为MSI-H结直肠癌,其中13例为dMMR,1例为pMMR;66例为MSS结直肠癌。免疫组织化学染色与多重荧光PCR-毛细管电泳检测结果具有强一致率(Kappa=0.955)。结论:H3K36me3及其表观遗传修饰蛋白质SETD2和KDM4B蛋白质的不同表达程度与结直肠癌发生、发展具有相关性。

仙灵骨葆胶囊对去势大鼠骨组织H3K36me3、H3K9me3及JMJD2A表达的影响

目的研究仙灵骨葆胶囊对去势大鼠骨组织中组蛋白H3第36位点赖氨酸三甲基化(histone H3 lysine36 trimethylation,H3K36me3)、组蛋白H3第9位点赖氨酸三甲基化(histone H3 lysine9 trimethylation,H3K9me3)和组蛋白去甲基化酶JMJD2A表达水平的影响。方法参照随机数字表法将24只SD雌性大鼠分为4组:空白对照组、阴性对照组、实验组、阳性对照组,每组6只。手术处理:空白对照组切除卵巢旁部分脂肪,另外3组大鼠经手术切除双侧卵巢。干预措施:术后1周,实验组给予仙灵骨葆胶囊(30.85 mg/100 g),阳性对照组给予福美加(11.7 mg/100 g),其余2组给予同体积蒸馏水。持续给药3个月后,HE染色观察骨微结构;采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)测组蛋白H3、JMJD2A mRNA表达,免疫印迹试验(Western blot)检测大鼠股骨髁骨组织的H3K36me3、H3K9me3、JMJD2A蛋白表达。结果空白组、实验组及阳性对照组骨微结构优于阴性对照组;空白组、实验组及阳性对照组骨组织中JMJD2A表达高于阴性对照组(P<0.05),空白组、实验组及阳性对照组各组组蛋白H3mRNA表达低于阴性对照组(P<0.05),空白组、实验组及阳性对照组各组H3K9me3及H3K36me3蛋白表达低于阴性对照组(P<0.05)。结论仙灵骨葆胶囊可改善去势大鼠骨质疏松症状,其机制可能与其提高去势大鼠骨组织中JMJD2A表达,抑制H3K36me3和H3K9me3的表达有关。

组蛋白去甲基化酶KDM7家族在脑疾病中研究进展

组蛋白去甲基化酶KDM7家族包括KDM7A、KDM7B、KDM7C三种蛋白,主要通过去除与转录沉默相关的特定组蛋白赖氨酸甲基化修饰,进而对基因转录发挥调控作用。目前,对KDM7家族的研究主要集中于其在神经分化、肿瘤发生发展等过程中的作用,而对其在脑神经疾病中的作用却知之甚少。本文从该蛋白家族表观遗传调控机制、结构生物学及其在脑神经疾病中的作用等方面进行了综述,以期为研究其在脑神经疾病中的功能机制提供参考,为理解脑神经疾病分子病理机制以及探索基于该机制的有效治疗靶点带来新的启示。

组蛋白H3K36me3与缺血再灌注诱导小鼠急性肾损伤的相关性研究

目的:研究组蛋白H3K36三甲基化(H3K36me3)在缺血再灌注(IR)诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠肾组织中的表达,分析其与肾组织中N-赖氨酸甲基转移酶SMYD2及肾损伤程度的相关性,为临床治疗IR-AKI提供新的靶点。方法:30只ICR小鼠随机分为IR组(n=15)和假手术组(sham组,n=15),应用微动脉夹夹闭双侧肾蒂45 min构建IR模型,于造模后24 h收取小鼠血清和肾组织标本。生化法检测血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr);HE染色检测肾组织病理学改变;免疫组织化学(IHC)染色检测肾组织中NGAL和cleaved caspase-3的表达;Western blot检测肾组织NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、P53、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、STAT3、p-STAT3、JNK和p-JNK1/2/3蛋白的水平。应用Pearson相关法分析H3K36me3与肾组织SMYD2及NGAL的相关性。结果:与sham组相比,IR组BUN和SCr水平显著升高(P<0.05);HE染色显示,IR组肾小管上皮细胞水肿、脱落、坏死,刷状缘脱落,管腔内大量细胞碎屑残留;IHC染色显示,IR组肾小管上皮细胞中NGAL和cleaved caspase-3明显增多;Western blot结果显示,IR组NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、cleaved caspase-3、Bax、STAT3、p-STAT3、JNK及p-JNK1/2/3蛋白的水平明显上调(P<0.05),Bcl-2蛋白水平明显下调(P<0.05);肾组织H3K36me3同SMYD2和NGAL的水平均呈显著正相关。结论:H3K36me3与IR-AKI小鼠肾损伤程度及肾组织SMYD2均密切相关,H3K36me3表达上调可能与STAT3和JNK信号通路活化共同参与调控IR-AKI的发生发展。

组蛋白赖氨酸去甲基化酶在肿瘤中的作用

在肿瘤发生过程中,组蛋白赖氨酸去甲基化酶(LSD1)的表达失调是一个重要标志。LSD1能够于组蛋白H3的N端与H3K4me2/1和H3K9me2/1相互作用,并使其去甲基化,从而调控多种不同的生理过程。同时,LSD1表达水平变化还与多种基因如p53、DNMT1和EZH2等的表达水平相关联,在胚胎发育、细胞分化和肿瘤增殖转移过程中起重要作用。

shRNA沉默NSD2基因表达对OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨干扰shRNA下调NSD2基因表达对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt /mTOR信号通路的影响。方法:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞,应用real time Q-PCR检测NSD2 mRNA的表达和Western blot法检测NSD2蛋白的表达,以鉴定NSD2 shRNA的沉默效果,应用CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot测定组蛋白H3K36二甲基化水平(H3K36me2)、BAX BCL-2、caspase-3、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)的变化。结果:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞72 h后,real time Q-PCR和Western blot检测显示NSD2的mRNA和蛋白表达均有明显下降(P<0.05),NSD2 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P<0.05),NSD2 shRNA组细胞的凋亡率明显高于对照组和和Neg shRNA组(30.37±4.22)%vs(1.36±0.52)%和(2.17±1.43)%(P<0.05);促凋亡蛋白BAX表达上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调,caspase-3表达上调;H3K36me2水平较对照组明显下降,而检测Akt /mTOR通路蛋白发现,Akt总蛋白水平未明显下降,但是活性形式的磷酸化p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K表达下调。结论:干扰沉默NSD2基因可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是调节组蛋白H3K36me2水平变化,特异性地抑制Akt /mTOR信号通路的活性。

组蛋白H3K36甲基化与疾病

组蛋白H3K36位点可以发生甲基化修饰,其修饰状态受到H3K36甲基转移酶和去甲基化酶的动态调控。H3K36的甲基化修饰可引起多种生物学效应,如参与基因的转录激活或抑制、剂量补偿以及基因的选择性剪接等。H3K36甲基化修饰状态的异常与很多疾病相关,因此全面了解H3K36甲基化对于该类疾病的诊断和治疗具有重要意义。

ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能研究

旨在探究缺失、小的、同源异形1(absent,small,or homeotic 1-like,ASH1L)甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能。本研究通过免疫荧光染色在健康母牛卵丘细胞中对ASH1L甲基转移酶进行定位,并分析细胞的组蛋白H3第36位赖氨酸(histone H3 lysine36,H3K36)甲基化修饰模式;合成靶向Ash 1L基因的siRNA,对siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及对照组进行荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹,筛选有效siRNA;采用荧光定量PCR分析干扰Ash 1L表达对处理组及对照组中凋亡相关基因及多梳抑制复合体(polycomb repressive complex 2,PRC2)组成基因的表达水平的影响。结果显示,ASH1L甲基转移酶位于牛卵丘细胞的细胞核中,呈点状分布。成功筛选到能有效干扰牛Ash 1L基因的siRNA-2,其干扰效率为60%~70%。将siRNA-2转染卵丘细胞后,该干扰组细胞中H3K36的单甲基化、二甲基化及三甲基化3种甲基化水平均显著低于对照组(P<0.05);干扰Ash 1L导致凋亡相关基因Bax、Bcl-2及caspase-3表达水平显著上调,凋亡基因Bax和caspase-3表达量高于抗凋亡相关基因Bcl-2(1.311和1.179 vs 1.146);同时,干扰Ash 1L基因表达也引起PRC2蛋白亚基EZH 2和Suz 12基因的mRNA表达量显著升高(P<0.05)。综上所述,本研究探讨了ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达和功能,ASH1L在牛卵丘细胞中呈点状分布,且Ash 1L基因的抑制导致H3K36me1/2/3水平均显著下降及凋亡基因和PRC2蛋白相关亚基EZH 2和Suz 12基因表达的升高,为进一步研究其对家畜胚胎的调控作用提供技术和理论基础。

过表达组蛋白甲基转移酶ASH1L对牛卵丘细胞增殖和凋亡的影响

旨在探究缺失的、小的、同源异形1(absent,small,or homeotic 1-like,ASH1L)过表达对牛卵丘细胞(cumulus cells,CCs)增殖和凋亡的影响。本研究将牛ASH1L SET结构域的cDNA序列克隆到pcDNA3.1上,构建牛ASH1L过表达载体;以导入pcDNA3.1+ASH1L载体的牛CCs为过表达组(ASH1L-OE),野生型牛CCs为对照组(Control),采用免疫荧光染色检测两组细胞中ASH1L表达水平和H3K36me1/2/3甲基化水平;通过流式细胞术分析ASH1L过表达细胞的凋亡和增殖情况;采用荧光定量PCR检测两组细胞中凋亡、增殖相关基因的mRNA表达水平。以牛CCs cDNA为模板,PCR扩增获得长2487 bp的牛ASH1L SET结构域DNA片段,与pcDNA3.1载体连接;经Nhe I/Not I双酶切和测序鉴定,成功构建过表达载体pcDNA3.1+ASH1L。过表达载体转染牛CCs后,细胞中ASH 1L mRNA及其蛋白表达水平、H3K36me1/2甲基化水平均显著升高(P<0.05)。另外,ASH 1L过表达显著提高了活细胞率(91.85±1.25)%vs.(87.39±1.71)%,降低了细胞凋亡率(8.08±1.21)%vs.(12.51±1.72)%,并显著下调了凋亡基因BAX和CASPASE-3 mRNA表达水平(P<0.05),上调抗凋亡基因BCL-2 mRNA表达水平(P<0.01)。ASH 1L过表达24、36 h时,细胞增殖率、增殖相关基因PCNA、CCND 2表达水平显著升高(P<0.05)。可见,ASH 1L过表达抑制了牛CCs凋亡,诱导了细胞增殖及H3K36me1/2甲基化水平的升高,为进一步研究ASH1L对CCs生长和卵泡发育的调控提供技术和理论基础。

组蛋白H3K36三甲基化在基因组中的作用及与疾病的相关性

组蛋白的翻译后修饰在基因的转录调控和损伤修复中发挥这重要的作用,其中H3的第36位赖氨酸位点的三甲基化修饰,已经被证明是一种功能性的蛋白修饰,对发育过程发挥这重要的调节作用。从酵母到人,这种甲基化修饰可以被含SET结构域的甲基转移酶(Set2)、含SET结构域的核受体(NSD1)、去甲基化酶KDM4A改变。具体来讲,H3K36三甲基化对基因的正常表达起着非常重要的作用,它不仅参与基因转录激活,它还参与多种生物过程,包括选择性剪切、剂量补偿、以及DNA修复。破坏H3K36三甲基化在染色质中的分布会导致多种人类疾病。由于环境及营养等多种因素影响H3K36三甲基化,在机体发育和生长过程中的关键基因因为H3K36三甲基化修饰发生改变,会使基因转录表达水平改变,剪切改变,DNA复制过程中发生错配修复缺失、CAG重复序列不稳定性改变、微卫星不稳定最终致使疾病的形成,如神经管畸形、血管畸形、亨特综合症、强直性肌营养不良、以及结肠癌等。因此,本综述拟从K36三甲基化修饰的功能以及功能受损后导致的疾病等几个方面对关于该修饰所做的近期报道进行总结。