UHRF2通过其PHD结构域与组蛋白H3K9乙酰化相互作用

目的:探讨UHRF2蛋白与组蛋白组蛋白H3第9位赖氨酸残基乙酰化(Histone H3 Lys9 acetylation,H3K9ac)的相互作用及两者相互作用结合区域的测定。方法:在LO2和Hep G2细胞中转染p CMV-FLAG-UHRF2,激光共聚焦分别检测UHRF2与组蛋白H3、H3K9ac和H3K14ac在细胞内的共定位。采用免疫沉淀技术分别检测UHRF2与组蛋白H3、H3K9ac和组蛋白H3第14位赖氨酸基乙酰化(Histone H3 Lys14 acetylation,H3K14ac)在细胞中的相互作用,以及用UHRF2的不同缺失体层粒分别与组蛋白H3K9ac相结合方法来检测UHRF2与之相互作用的功能性结合区域。结果:(1)UHRF2与组蛋白H3、H3K9ac和H3K14ac在LO2和Hep G2细胞中存在共定位现象。(2)在LO2和Hep G2细胞中,UHRF2与H3K9ac相互结合。(3)在正常肝细胞LO2中,UHRF2与H3K9ac相互作用的结合区域为PHD结构域。而在肝癌细胞Hep G2中,除了PHD结构域以外,YDG/SRA结构域也是UHRF2与H3K9ac的关键结构域。结论:UHRF2通过其PHD结构域与H3K9ac相互作用。

小鼠孤雌胚、体外培养胚与体内胚H3K9乙酰化模式的比较

孤雌胚胎的发育率比体内体外生成胚胎的发育率要慢,为研究小鼠孤雌胚、体外培养胚H3K9乙酰化(H3K9ac)模式与体内自然胚之间的差异、曲古抑菌素A(Trichostatin,TSA)对孤雌胚H3K9乙酰化模式的影响及表观遗传模式对孤雌胚、体外培养胚发育的影响,文章采用间接免疫荧光法对小鼠植入前各时期孤雌胚、体外培养胚及体内自然胚基因组组蛋白的H3K9乙酰化水平进行检测。结果显示,植入前各时期孤雌胚H3K9乙酰化模式与体内组变化趋势基本一致,但平均荧光强度较体内组普遍偏高;经TSA处理后孤雌胚H3K9乙酰化水平有所提高,原核期至8-细胞期差异显著(P<0.05)。体外培养胚H3K9乙酰化荧光强度与体内组变化趋势也基本一致,但平均荧光强度较体内组普遍偏低。以上结果表明,小鼠孤雌胚H3K9乙酰化水平高于体内胚,使植入前胚胎发育过程中本应沉默的基因启动子发生超乙酰化,进而抑制胚胎发育,这可能是造成孤雌胚胎发育能力较差的重要原因之一;TSA处理可以部分弥补体外培养环境对胚胎发育带来的伤害,但TSA提高孤雌胚的发育能力可能并不完全是通过改变H3K9乙酰化水平来实现的。

UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进H3K9乙酰化抑制细胞增殖

目的探讨UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中对H3K9乙酰化及细胞增殖的影响。方法体外培养HEK293细胞,构建羟基脲所致的DNA损伤细胞模型;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒,用Western blot评估p CMV-3×Flag-UHRF2转染效率及H3K9乙酰化水平;CCK8法检测HEK293细胞增殖。结果 HEK293细胞经2.5 mmol/L羟基脲处理12 h后,DNA出现了明显的损伤;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒后,UHRF2蛋白表达显著升高(P<0.01);DNA损伤应答中H3K9乙酰化显著增加(P<0.05);细胞增殖能力明显下降(P<0.05)。结论 UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进组蛋白H3K9乙酰化抑制细胞增殖。

胸腺肽a1联合恩替卡韦治疗抗乙型肝炎病毒患者对H3K9乙酰化修饰蛋白与Toll样受体9结合变化的研究

目的探讨胸腺肽a1(Ta1)联合恩替卡韦治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染患者对其体内H3K9乙酰化修饰蛋白与Toll样受体9(TLR9)结合情况的影响,分析联合治疗促进抗病毒疗效的潜在机制。方法选取2017年12月至2019年2月东莞市第九人民医院收治的3例慢性乙型肝炎患者为研究对象进行回顾性分析,采用免疫共沉淀(ChIP)、二代测序技术及液相色谱–质谱联用技术(LCMS/MS)检测联合治疗过程中患者血液内H3K9乙酰化修饰与TLR9结合变化。结果恩替卡韦和Ta1联合用药对3例HBV慢性乙型肝炎患者临床效果较好,免疫共沉淀PCR反应产物发现TLR9部分序列,在治疗好转的过程中与TLR9序列匹配度更好。通过DNA序列分析也发现H3K9Ac在其他细胞模型中具备同一区域修饰模型的变化。结论恩替卡韦和Ta1联合用药治疗会增加TLR9在mRNA和蛋白水平的表达,更好地发挥抗病毒作用。

组蛋白乙酰化修饰调控NF-κB驱动的PNPLA3基因表达的机制初探

目的探讨禁食/再喂食后小鼠肝脏Patatin样磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)基因启动子核因子-κB(NF-κB)结合区域组蛋白H3K9乙酰化(H3K9ac)水平以及相关去乙酰化酶(HDAC)和乙酰化转移酶(HAT)的变化特点。方法根据体质量将18只C57BL/6小鼠随机分为3组各6只,分别为自由饮食组、禁食组(夜间饥饿24 h)和再喂食组(饥饿24 h后再自由摄食高蔗糖含量饲料12 h),分别予自由饮食、禁食和禁食后再喂食干预,检测并比较各组肝脏PNPLA3、NF-κB、HDAC(SIRT1、SIRT6)和HAT(GCN5、Elp3)基因表达情况,用染色质免疫共沉淀-定量PCR检测H3K9ac富集水平,并分析H3K9ac与PNPLA3表达的相关性。结果 3组比较,C57BL/6小鼠肝脏PNPLA3、NF-κB基因表达在禁食时下调,再喂食后又上调(P均<0.001)。H3K9ac水平变化与PNPLA3变化趋势一致(P均<0.05),相关分析提示两者具有相关性(rs=0.958, P <0.001);禁食组SIRT1和SIRT6表达水平较自由饮食组高,再喂食组两者水平均下降(P均<0.05),与H3K9ac变化趋势相反;GCN5、Elp3表达变化与SIRT1及SIRT6类似(P均<0.05)。结论 SIRT1和SIRT6相关H3K9去乙酰化涉及饮食调节NF-κB驱动的PNPLA3的表达。

SAHA处理供体细胞对山羊克隆胚胎早期发育的影响

为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂羟肟酸(SAHA)对体细胞和山羊核移植胚胎早期发育的影响,采用不同浓度SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其AcH3K9水平、细胞增殖能力、细胞周期及胚胎发育情况、乙酰化水平、多能性基因的表达水平。结果显示,SAHA处理后GEFs的AcH3K9水平显著上升(P<0.05),2.5μmol/L SAHA处理浓度即可显著提高GEFs组蛋白H3K9的乙酰化水平;浓度≤2.5μmol/L时,对细胞增殖能力无明显影响;浓度为5.0μmol/L和10.0μmol/L时,细胞活力显著下降(P<0.05)。AcH3K9上调会引起G0/G1和S期的细胞比例下降(P<0.05)。因此,选择经2.5μmol/L SAHA处理的供体细胞进行核移植。试验组的胚胎卵裂率和囊胚率显著高于对照组(P<0.05),其卵裂率接近于卵胞质单精子注射(ICSI)组。试验组的囊胚率乙酰化水平显著高于对照组,且低于ICSI组(P<0.05)。与对照组相比,试验组囊胚的Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表达水平均上升(P<0.05),且均接近于ICSI组。说明,选用2.5μmol/L SAHA处理供体细胞可提高体细胞核移植效率和胚胎品质。

先天性巨结肠患儿结肠组织中配对盒基因6低表达的分子机制

目的探讨配对盒基因6(paired box 6,PAX6)在先天性巨结肠(Hirschsprungs disease,HSCR)患儿结肠组织内低表达的分子机制。方法选取24例HSCR患儿巨结肠根治术后痉挛段结肠组织为HSCR组,同期18例新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)手术切除坏死肠段两端正常结肠组织为NEC组作为对照。采用实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹法检测两组结肠组织内PAX6的表达水平,染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应法检测两组结肠组织中PAX6启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平及E1A结合蛋白p300(EP300)结合水平。结果HSCR组PAX6 mRNA和蛋白表达水平明显低于NEC组(0.13±0.05比1.08±0.45,0.41±0.12比0.82±0.12),PAX6启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平和EP300结合水平也明显低于NEC组(0.45±0.17比1.38±0.59,0.32±0.15比1.45±0.49),差异均有统计学意义(P<0.01)。HSCR组PAX6表达水平与其启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平成正相关(r=0.664,P<0.05),H3K9乙酰化水平与EP300结合水平成正相关(r=0.624,P<0.05)。结论HSCR患儿结肠组织中PAX6低表达可能与其启动子区EP300结合减少导致H3K9乙酰化水平下调有关。