H3N2亚型犬流感病毒实验感染模型的建立

【目的】建立H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)实验感染模型,了解犬流感的发病特征,为疫苗效力评价奠定基础。【方法】6—13月龄CIV血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)抗体阴性(HI<1﹕10)比格犬26只,其中3只鼻腔喷雾PBS作为阴性对照,另23只分5组(10、103、105、106、107 EID50/只),分别为3、5、5、5、5只/组,每只犬各鼻腔喷雾H3N2亚型CIV(A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2),简称HB株)病毒液1mL。观察临床症状、肺脏病变和肺脏组织病理学变化,计算肺实变率,检测病毒和HI抗体效价。【结果】10 EID50剂量感染组,3只犬均未出现明显临床症状,肺脏均无明显眼观病变,肺脏实变率0%,无组织病理学变化,病毒检测均为阴性,HI抗体效价几何平均值(geometric mean titer,GMT)为1﹕15.9;103 EID50剂量感染组,5只犬中有4只喘息、流鼻汁和咳嗽,1只犬未表现出临床症状,2只犬肺脏出现轻微实变,实变率平均为1.4%,4只犬病毒分离阳性,HI抗体效价GMT为1﹕320;105 EID50剂量感染组,5只犬在攻毒后5 d开始出现流鼻汁和咳嗽等临床症状,肺脏均有实变,实变率平均为4.2%,肺泡间隔增宽,病毒分离均为阳性,HI抗体效价GMT为1﹕2940.7;106 EID50剂量感染组,5只犬在攻毒后4 d体温升高、流鼻汁、咳嗽,临床症状出现较105 EID50剂量感染组早1 d,肺脏实变程度增加,实变率平均为17.9%,肺泡间隔增宽,病毒分离均为阳性,HI抗体效价GMT为1﹕2228.7;107 EID50剂量感染组,5只犬在攻毒后3 d表现出体温升高、流鼻汁、咳嗽等严重的临床症状,症状出现较106 EID50剂量感染组早1 d,肺脏严重实变,实变率平均为29.0%,肺泡间隔增宽,病毒分离均为阳性,HI抗体效价GMT为1﹕2940.7;对照犬均未出现明显临床症状,肺脏均无明显眼观病变,无组织病理学变化,病毒检测均为阴性,HI抗体效价均<1﹕10。【结论】106 EID50剂量病毒是能引起犬明显发病的最小病毒接种剂量,建立起H3N2亚型CIV实验感染模型。

H3N2亚型猪流感病毒中国分离株的克隆纯化及生物学特性

以有限稀释克隆法对 2 9株 H3N2亚型猪流感病毒 ( SIV)不同地区分离株进行纯化 ,并对其生物学特性进行了研究。结果 ,8株对鸡呈现中等致病力 ,2 1株对鸡呈现低致病力。不同地区 SIV分离株 (第 5代 )的 EID50 差异较大 ,以安徽分离株最高 ,为 10 - 1 0 .77/ 0 .2 m L,其他毒株在 10 - 5.5～ 10 - 1 0 .56 / 0 .2 m L 之间。黑龙江省分离株和浙江省分离株的L D50 高达 10 - 2 .84 / 0 .1m L ,其他分离株在 10 - 1 .1 7～ 10 - 2 .56 / 0 .1m L之间。经鸡胚分离传代后 ,SIV分离株均能凝集0 .7%人“O”型血、绵羊、兔、豚鼠、小鼠、大鼠及鸡的红细胞 ,其红细胞凝集谱的差异主要表现在对马、牛、驴、猪红细胞的凝集特性上。大部分 SIV分离株为热不稳定型 ,部分毒株表现为中等热稳定型和热稳定型。从其抗原特性看 ,大部分 SIV分离株表现为亲和相 ,对 AIV参考毒株 DKUK6 3和 SIV参考毒株 SWTN77表现出较高的 HI滴度 ;部分分离株经鸡胚传代后 ,出现了相别的变异。

H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.99015(H3HA)和0.99947(N2NA)。检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%。表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

2010-2012年福建省H3N2亚型流感病毒血凝素基因特征分析

目的通过对2010—2012年福建省分离的H3N2亚型流感毒株血凝素HA1基因进行分析，了解2010-2012年福建省H3N2亚型流感病毒的基因特征和变异规律。方法随机选择28株毒株，提取病毒RNA，采用RT-PCR扩增目的片段，纯化PCR产物后进行测序；利用DNAstar和Mega4．0等生物信患学软件进行核苷酸整理、拼接、校对、差异性比较以及基因进化树构建等分析研究。结果28株H3N2亚型流感病毒HAl区核苷酸同源性在96．4％～100％之间。基因系统进化分析显示，其进化规律都是沿着树枝主干随着时闻推移向，上延伸，序列的差异和年代成正比。2010—2012年间HAl区共出现43个氨基酸位点的变化，其中有10个氨基酸位点变异累计涉及4个抗原决定簇，2个变异位点发生在受体结合位点（RBS）及其附近，应予高度重视。结论相对于A／Perth／16／2009疫苗代表株，2012年的部分H3N2亚型流感出现了抗原漂移；部分毒株已出现氨基酸位点的改变，并涉及抗原决定簇及受体结合位点，提示2010—2012年福建省人群中流行的H3N2亚型流感正逐渐发生变异，应加强流感病原学监测，以及时发现新的流感变异株，为福建省流感防控提供科学依据。

2002年广东省H3N2亚型流感病毒流行的分子基础

目的 了解广东省2002年H3N2亚型流感病毒流行及抗原性变异情况。方法 用狗肾传代细胞(MDCK)和鸡胚进行流感病毒分离,用交叉血凝抑制实验对毒株进行抗原性分析;提取病毒RNA,用一步法RT-PCR扩增血凝素基因(H3A),产物纯化后,并将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析。结果2002年1～10月共获得流感病毒246株,其中H3N2亚型210株,占85.4％,H1N1亚型2株,占0.8％,B型34株,占13.8％;2002年流感流行的高峰是6月;抗原性分析显示,2002年广东省H3N2亚型流感病毒A/粤/236/2002和2001年流行株A/粤/448/2001以及目前国内代表株A/闽/151/2001的抗原比分别是5.6和4.0;其HA1区氨基酸序列和国际代表株A/悉尼/5/97同源性为94.2％,有19个氨基酸差异,其中发生在抗原决定族A、B、E上的有6个,受体结合部有3个。结论2002年广东省流感病毒以H3N2亚型为主,其流行的分子基础是基因变异导致抗原性发生漂移。

2009～2013年广西H1N1和H3N2亚型猪流感病毒血清学调查

摘要：【目的】了解广西H1N1和H3N2亚型猪流感病毒（SIV）的存在形势及其流行规律，为下一步有效监测和防控猪流感（SI）提供理论依据和原始溯源。【方法】对2009～2013年于广西11个地级市的屠宰场、规模化养猪场和个体养殖户采集的1170份猪血清进行血凝抑制（Hr）试验检测，统计欧洲禽源H1N1（EA．H1N1）亚型和新型人源重组H3N2（Hu．H3N2）亚型4株毒株（LB144和BB2、NNXD和JGB4）的抗体阳性率，并分析H1N1和H3N2亚型毒株的存在形势及其流行规律。【结果】2009-2013年，EA．H1N1亚型LB144毒株的平均抗体阳性率高达20．68％，且保持稳定，是广西地区主要的流行毒株；Hu．H3N2亚型JGB4毒株从2010年开始流行，且呈逐渐蔓延的趋势，平均抗体阳性率为19．96％。广西北海、南宁、玉林、贺州、桂林、贵港和柳州市受到EA—H1N1和Hu—H3N2亚型毒株多重感染，且感染程度较严重；百色、河池和防城港市的感染程度相对较低。育肥猪最易感染SIV，尤其是BB2和JGB4毒株，其抗体阳性率分别达66．00％和40．00％。EA—H1N1亚型毒株间的交叉感染阳性率（21．52％）略低于Hu—H3N2亚型毒株间的交叉感染阳性率（27．45％），而两株不同亚型毒株交叉感染时以BB2与JGB4毒株的交叉感染阳性率最高（16．23％），3株交叉感染时以BB2、NNXD和JGB4毒株间的交叉感染阳性率最高（11．60％），4株同时交叉感染阳性率也有6．96％。【结论】广西猪群已普遍存在EA-H1N1和Hu．H3N2亚型毒株混合感染的现象，尤其是地处两省边界上的地级市感染更严重，并以育肥猪和保育猪较易感。因此在sI防控工作中，除做好哺乳仔猪和种猪的日常管理外，还应减少保育猪的外来应激，适当调整育肥猪的饲养密度，以减少新型SIV重组毒株的产生。

表达H3N2亚型猪流感病毒HA的重组伪狂犬病病毒对仔猪的免疫效力评价

利用猪流感病毒(Swineinfluenza virus,SIV)与伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)血清学阴性的4周龄断奶仔猪,对此前构建的表达SIVA/Swine/Inner Mogolian/547/2001(H3N2)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力评价。按每头105.0PFU rPRV-HA肌肉注射断奶仔猪(n=12),同时设Bartha-K61免疫对照组(n=5)和非免疫攻毒对照组(n=5)。免疫后35d用2×105.0TCID50的SIVA/Swine/Heilongjiang/74/2000(H3N2)进行强毒攻击。rPRV-HA免疫组免疫后7d均可检测到高滴度针对SIV的血凝抑制(HI)抗体,而所有对照组小猪仅在攻毒后7d才开始产生针对SIV的HI抗体;rPRV-HA免疫组在病理学保护方面明显优于对照组,支气管和肺泡冲洗液病毒分离结果显示,攻毒后7d rPRV-HA免疫组没有检测到病毒,而两个对照组可检测到病毒。以上试验结果表明,rPRV-HA免疫猪对同亚型SIV的攻击具有很好的保护作用。

H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

为了解广州地区犬流感的流行情况,本研究采集107份犬鼻咽拭子样品和58份血清样品,SPF鸡胚分离病毒并进行抗体检测。结果显示:分离获得3株H3N2亚型犬流感病毒。分离株的EID50为10-2.42/0.1 mL～10-3.5/0.1 mL;MDT为177.6 h～192 h;对乙醚、氯仿、酸和温度均敏感;对血凝素为热不稳定型;能够凝集公鸡、豚鼠、猪和牛的红细胞。

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析

本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2)。该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7%～98.1%、94.4%～99.5%和88.6%～97.6%;与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7%～98.5%、82.5%～99.9%和87.6%～98.4%;M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1%以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6%以上。基因型分析表明分离株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒"混合器"的作用。

杭州市2013～2014年流感暴发流行期甲型流感病毒H3N2亚型基因特性分析

目的分析杭州2013~2014年冬春季流感暴发期间流行的甲型流感病毒H3N2亚型的分子特性。方法选取H3N2阳性标本提取病毒RNA,PCR扩增全基因组并测序,构建血凝素（HA）及神经氨酸酶（NA）分子进化树,对H3N2亚型的病毒进化进行分析。结果 6个代表株中H3N2未发生片段间的重配。以WHO推荐流感疫苗株A/TEXAS/50/2012为参考,HA1蛋白主要抗原决定区发生N145S氨基酸替换,并有其他多个位点的突变。病毒基质蛋白（M2）的金刚烷胺耐药位点全为S31N,神经氨酸酶抑制剂耐药位点未发生突变。结论 H3N2亚型甲型流感病毒HA1蛋白的氨基酸变异与2013~2014年杭州地区暴发流行有关。另外,病毒已出现对金刚烷胺的耐药突变,而对神经氨酸酶未发生耐药突变。

1996～2005年中国H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶基因特性分析

测定了1996～2005年间在中国分离并保存的395株H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶（NA）基因序列，应用生物信息学工具进行了分析。结果表明：NA基因序列的进化树表现为一主要进化主干伴随多侧分支进化，同一年份的毒株可以分为几个分支存在；疫苗株在NA基因序列进化树上存在明显的滞后现象；NA没有氨基酸的丢失与插入；抗原决定簇大部分位点保守且各抗原决定簇之间的变异情况各有特点，其中197～199位、431～434位和339～347位点的变异频率最高，而153位、328～336位、367～370位、400～403位抗原决定簇的氨基酸变异频率相对比较小；除了抗原决定簇外还有些氨基酸位点的变异频率很高，它们分别是18、23、30、93、143、208、216、221、249、265、267、307、385、437位氨基酸，其中143位和267位这两个位点的变异频率高于抗原决定簇位点，具体生物学意义还需要进一步研究；NA蛋白的酶活性中心位点高度保守；二硫键和糖基化位点保守。NA基因的这些特点为流感的预防、控制以及NA抑制剂药物的应用提供了一定的参考依据。

2株鸭源H3N2亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

2008年10月到2009年9月从扬州活禽市场采集家鸭泄殖腔拭子共1075份,并从中分离鉴定了24株H3亚型禽流感病毒,作者对其中的2株病毒进行了全基因测序和遗传演化分析,发现2株病毒均为H3N2低致病性禽流感病毒。分离病毒各基因遗传进化分析均与猪源分离株的亲缘关系相对较近,与人源分离株的亲缘关系较远;除HA基因外,其它所有的基因均发生了不同程度基因重组,各基因与不同亚型、不同地区、不同宿主分离的不同毒株发生了基因重排。

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒（A/Swine/Guangdong/01/2005（H3N2））,对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994（H1N1）的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988（H1N1）的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。

一株H3N2亚型犬流感病毒的分离与进化分析

2012年从南京市某宠物医院采集的20份犬鼻拭子中分离到1株犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）,命名为A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）.该病毒分离株的血凝素（hemagglutinin,HA）效价为28,鸡胚半数感染量（median embryoinfective dose,EID50）和最小致死量平均死亡时间（mean death time,MDT）分别为10-7.60/0.1 mL和69.6h/10-4.血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因和核蛋白（necleoprotein,NP）基因的系统发育进化树均显示该分离株CIV位于禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）亚群中,并与H3N2亚型CIV辽宁分离株和黑龙江分离株位于同一分支上,具有最近的亲缘关系（HA基因的同源性为99.5％～99.6％,NA基因的同源性为99.0％～99.2％,NP基因的同源性为99.1％～99.3％）.氨基酸序列分析显示,该病毒分离株与其他犬流感病毒分离株的HA、NA和NP氨基酸序列存在个别位点的突变.

H3N2亚型猪流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

采用RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒HA1基因。将该片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中,构建原核表达载体pET-HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21,经IPTG诱导,HA1基因获得表达,其重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定表达HA1基因的最佳诱导条件。Western blot分析表明表达产物具有良好的抗原活性。用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测H3亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,阳性标准初步判定为:待检血清OD值>0.4,而且待检血清OD值/阴性血清OD值>2。应用此方法对309份临床血清样品进行了检测,并与HI方法进行了比较,结果表明基于重组HA蛋白的间接ELISA方法可用于H3N2亚型猪流感病毒感染的初步诊断。

H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。

深圳市2007年H3N2亚型流感病毒基因特性分析

目的了解深圳市2007年H3N2亚型流感病毒流行情况及血凝素基因特性。方法用狗肾传代细胞(MDCK)和鸡胚进行流感病毒分离。收获病毒后提取病毒RNA,进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送大连宝生物公司纯化及测序。测序结果用Simmonic软件和Mega3.1软件进行序列分析。结果H3N2亚型流感毒株为深圳市2007年流感流行的优势株,与2006年的深圳株比较未发生明显变异,但与2007年的疫苗株相比,有多个位点的氨基酸发生了替换,造成了其间的抗原性发生了一定的变化。结论深圳市2007年H3N2亚型流行株,并未形成一个新的变种。推测是由于与疫苗株之间的抗原性的变异导致了2007年深圳市H3N2亚型流感的流行。

人源H3N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2005的分离鉴定及全基因遗传演化分析

2005年从广东某猪场采集疑似流感病猪的病料(气管和肺脏)样品共40份,通过MDCK细胞培养分离到6株A型流感病毒,经过血凝抑制和PCR扩增方法鉴定均为H3N2亚型。挑选其中一个代表株A/swine/Guangdong/1/05(H3N2)(SwGD1/05)进行全基因组测序并与GenBank中相关序列比较,结果发现SwGD1/05的8个基因分别与人流感病毒相关基因氨基酸同源性高达98.5%～99.4%;SwGD1/05的8个基因进化树中分别位于北美和欧洲人流感病毒进化谱系位置;由此推测SwGD1/05可能来源于北美或欧洲人源流感病毒株。这一结果为阐明猪作为流感病毒传播的中间宿主作用提供了的理论支持,本研究具有重要的人类公共卫生意义。

H3N2亚型流感病毒分离株全基因组序列特征分析及其临床意义

目的分析H3N2亚型流感病毒流行株的全基因组序列及其与临床特征的相关性。方法检测2014年12月—2015年3月收集的呼吸道感染患者鼻拭子样本,对其中H3N2亚型流感病毒株PCR扩增后直接进行全基因组测序,分析其核酸序列特征及氨基酸变异情况。结果与WHO推荐2014—2015流感疫苗株参考病毒株相比,来自不同患者的14个病毒株HA1蛋白抗原决定簇均发生不同程度突变,抗原决定簇结构改变较明显的病毒株其宿主具有更高的体温和更严重的临床表现。全部14个病毒株发生HA1蛋白E190D氨基酸突变。6个病毒株NA蛋白出现1个新增糖基化位点。1个病毒株存在导致金刚烷胺耐药的M2蛋白V27A突变。全部14个病毒株PB1-F2蛋白发生I18T突变。结论 M2蛋白耐药突变的出现和PB1-F2蛋白氨基酸突变提示分离获得的H3N2流感病毒株在进化过程中曾经结合H1N1亚型流感病毒基因片段。HA1蛋白抗原决定簇突变的增加可能引发患者更强的免疫反应。

H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 k Da,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。