3株表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力比较

作者旨在探讨鸡痘病毒ORF073或ORF214基因缺失后,在母源抗体存在情况下对重组病毒免疫效力的影响。将构建好的在ORF073或ORF214基因插入H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)及单表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)分别免疫SPF鸡和商品鸡,检测重组疫苗诱导的免疫效力。结果:3种重组鸡痘病毒在SPF鸡产生较高的HI抗体效价及100%的免疫保护;在HI母源抗体效价为2.45的商品鸡体内基因缺失株重组病毒比rFPVLP-12LSH5A易于清除,抗体上升缓慢而且免疫28 d后HI抗体效价较低,免疫保护率低,分别为16.7%和23.3%;在母源HI抗体效价为0的商品鸡体内基因缺失株重组病毒免疫后产生的抗体效价高,免疫28 d后分别达到3.50和3.17。结果表明在商品鸡体内母源抗体影响下,缺失ORF073或ORF214基因的重组鸡痘病毒的免疫效力降低。

抗H5亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

制备抗H5亚型AIV血凝素单克隆抗体;依据淋巴细胞杂交瘤技术,用纯化的H5N1亚型AIV和重组噬菌体T4-H5HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用ELISA方法筛选特异性单克隆抗体;获得6株抗H5亚型AIVHA的特异性单克隆抗体H5-01(1E6)、H5-02(2C2)、H5-03(2A8)、H5-04(2G6)、H5-05(2E9)和H5-06(3F6)。各株单抗亚型测定的结果为:H5-01、H5-02为IgG1,H5-03、H5-04为IgG2a,H5-05、H5-06为IgG2b,轻链的亚型均为kappa链;经特异性和与同型病毒的反应谱检测,6株均是抗H5亚型AIVHA特异性单克隆抗体,为进一步分析H5N1亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。