H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

2019-2022年中国H6N1亚型禽流感病毒的生物学特性分析

【背景】H6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)广泛流行于我国南方地区,是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配,并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段,产生新型重组病毒,进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究,为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省(直辖市、自治区)的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子,通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序,分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明,7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高,基因来源复杂,具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明,H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播,欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源,根据贝叶斯演化分析结果,推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成,后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示,病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF,符合低致病性AIV特征;此外,另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变,据报道,该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明,部分毒株具有双受体结合特性,但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明,鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒,并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒,病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明,H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制,但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒,候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国;部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制,表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

2.3.2.1分支H5N1亚型禽流感病毒的遗传演化和生物学特性研究

H5N1亚型禽流感病毒(AIV)引发的高致病性禽流感造成了全世界范围内家禽生产的巨大经济损失。其中,2.3.2.1分支H5亚型AIV已经在多个国家和地区的野鸟及家禽中被分离到,是重要的病毒进化分支之一。流行病学调查结果显示通过野鸟携带的该分支病毒在我国传播,我国内地家禽中也存在2.3.2.1分支的病毒。所以开展该分支病毒的进化监测研究,对我国H5亚型AI的综合防控具有重要意义。

1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒遗传演化分析

为分析1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,对2021年从北京圆明园遗址公园送检的黑天鹅样品中鉴定出的1株H5N8亚型禽流感病毒(A/Wild swan/China/Beijing0201/2021)的全基因组进行扩增、克隆与序列测序,并应用分子生物学软件对其进行遗传演化及关键氨基酸位点分析。结果显示,该H5N8亚型禽流感病毒株属于clade2.3.4.4b进化分支,其PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、MP、NS基因均与H5N8亚型AIV的相应基因片段具有较高同源性,且与2020-2021年越南、哈萨克斯坦、俄罗斯、柬埔寨、法国等地的H5N8毒株密切相关。氨基酸位点分析显示,该毒株HA蛋白裂解位点呈现高致病性禽流感病毒的分子特征,且出现S137A、T160A、T192I、S227R氨基酸突变,158位缺失糖基化位点,这些位点的突变均能够增强H5亚型禽流感病毒对人源唾液酸受体结合的能力;该毒株的PB2蛋白、NP蛋白、M1蛋白和NS1蛋白均存在多个可以增强流感病毒在哺乳动物体内的复制能力和致病性的关键氨基酸位点。研究结果可为H5N8亚型禽流感病毒的进化规律研究及综合防控提供参考。

2019—2021年华东地区6株禽源H3亚型流感病毒的遗传进化分析

H3亚型流感病毒在自然界广泛存在,可感染人、猪、马、犬、禽等众多宿主并能发生跨种间传播,危害不容忽视。本研究于2019—2021年在华东地区活禽市场采集表观健康的家禽喉头与泄殖腔棉拭,通过血清学试验鉴定、筛选出6株代表性水禽源H3亚型流感病毒,并经RT-PCR试验确定5株为H3N2亚型、1株为H3N1亚型。进一步对6株分离株进行全基因组测序、同源性比对和遗传进化分析,结果显示:HA蛋白裂解位点处均为PEKQTR/GLF,不存在连续碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;受体结合位点处均为禽源特征性的226Q和228S,提示其跨种传播至哺乳动物的潜能较低;内部基因片段来源多样化,与H3N8、H4N6、H5N8、H6N1、H7N7、H0N3等众多亚型禽流感病毒的亲缘关系密切;除JS1018/19和JS1094/19的NS基因属于北美谱系以外,其余均属于欧亚谱系的禽源分支,与犬、马、猪、人等哺乳动物源毒株的亲缘关系较远,提示虽然可能存在不同进化谱系间的基因重组但并未发生从禽到哺乳动物宿主的基因交换。该研究结果丰富了H3亚型禽流感病毒的流行病学数据,为进一步了解我国低致病性禽流感病毒的分布特征提供了参考依据。

2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒分子特征和遗传进化分析

目的分析2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒的分子特征和遗传进化特点,为禽流感防控提供参考依据。方法对2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型单阳性标本进行复核,筛选出Ct值小于30的标本,对HA和NA基因进行靶向扩增和二代测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,使用生物信息学软件分别对HA和NA基因进行分子突变位点和遗传进化分析。结果共完成12株H5亚型HA和NA全基因测序。序列比对结果显示,HA基因最高一致性在98.59%~99.89%,NA基因最高一致性在98.19%~99.85%。遗传进化分析显示,HA基因归属于Clade 2.3.4.4h分支,NA基因归属于欧亚谱系H5N6和H6N6分支。12株毒株的裂解位点均为高致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点为禽源受体,但S123P、S133A、I151T、T156A突变可增强病毒与人源受体的亲和力。HA基因糖基化位点分析显示,常见154位糖基化位点缺失,在124位(-NHTS)新增潜在糖基化位点。结论2018-2019年福建省禽类外环境中存在Clade 2.3.4.4h进化分支H5N6高致病性禽流感病毒,并且N6基因在进化上具有多样性,提示基因进化重组的可能,需加强对病毒分子进化的持续监测。

H5N1亚型禽流感病毒的鸭致病性研究

【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(IVPI=3),而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,肝脾肿大并见有坏死灶,肺脏严重充血、出血,消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征,并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6d,致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气管、泄殖腔及全身各主要器官均可分离到病毒。虽然攻毒后14d耐过鸭血清中可检测到1∶16的HI抗体;但是此时胰腺中仍然可分离到低水平的病毒。【结论】本研究继从野鸟分离到对鸭具有高致病性禽流感病毒之后,首次证实家禽中也存在对鸭具有高致病性的禽流感病毒流行。

H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:预测H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性。方法:依据近年H5N1亚型禽流感病毒流行趋势,下载得到相关HA蛋白氨基酸序列。进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性。通过BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清,初步鉴定候选表位抗原性。结果:综合多项预测及空间构象模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA141～155、HA206～223、HA302～316。候选表位处于H5N1亚型禽流感HA1蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H5N1亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性。而不同候选表位在BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能。结论:所筛选的表位具有成为H5N1亚型禽流感病毒HATh和B细胞相关抗原表位的可能。本研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H5N1亚型禽流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础。

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因 ,将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中 ,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,HA1基因获得表达 ,重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达HA1基因的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 8mmol L ,诱导时间为 3h。Westernblot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明 ,抗原的最佳包被浓度为 4 μg mL ,血清的最佳稀释度为 1∶2 0 0 ,阳性标准初步定为 :OD待检血清>0 5 ,且OD待检血清 OD阴性血清 >2。

H5N1亚型禽流感病毒NS第263~277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义，构建H5N1A／D／SD／04株HA、NA、NS的全基因表达／转录载体，以及NS的删除突变载体（m248），A/D/YZ/04株的NS基因表达／转录载体（848）和其补加15个核苷酸的NS突变载体（m848）。构建的载体分别与编码WSN（H1N1）内部基因载体进行组合转染，拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒：RWSN-848和RWSN—m248在263-277位缺失15个碱基。RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价（HA）、鸡胚的平均死亡时间（MDT）和鸡胚半数感染量（EID50）均无显著差异；但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN—m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263～277位核苷酸发生缺失后，不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能，但提高了病毒对鸡的致病力。

表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的重组鼠白血病病毒的特性

通过反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增了H5N1亚型鹅源禽流感病毒 (AIV)完整的血凝素 (HA)基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果已经登陆GenBank ,登陆号为AY6 394 0 5。序列分析表明所扩增的HA基因开放性阅读框架 (ORF)由170 7个核苷酸组成 ,共编码 5 6 8个氨基酸 ,裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF ,含连续的碱性氨基酸 ,具有高致病性AIVHA基因裂解位点的特征。构建了含HA基因的真核表达载体pcDNA HA ,通过与鼠白血病病毒 (MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT6 0和pHIT111共转染人胚肾细胞 2 93T ,4 8h后收集假病毒上清 ,超离后通过Western blot证明HA蛋白能够在假病毒颗粒表面表达 ,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染 2 93T、COS 7和NIH3T3三种不同的靶细胞 ,证实所构建的假病毒粒子具有感染性和泛嗜性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV HA假病毒体系 ,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。

虎源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立

为研究H5N1亚型禽流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,利用本室分离鉴定的虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株(简称HAB/01)H5N1亚型禽流感病毒进行连续10倍稀释后,对4～6周龄雄性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠,测定其MLD50,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为14d。结果感染小鼠呈现出规律的以肺炎为主的临床症状、病理变化及病死率;测得该病毒对小鼠的MLD50为10-7.1/0.05mL。成功建立了虎源H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠的实验模型。

禽流感病毒H1、H3、H5、N2亚型多重RT-PCR检测方法的初步研究

目的根据禽流感病毒H1、H3、H5亚型的HA基因和N2型NA基因的保守序列,设计出四对RT-PCR引物,建立一步法多重RT-PCR对禽流感H1、H3、H5、N2四亚型进行快速检测。方法利用所设计的四对引物,通过对该方法扩增条件的优化,成功建立快速检测禽流感病毒H1、H3、H5、N2四亚型的一步法多重RT-PCR。利用禽流感H1、H3、H5、N2四亚型毒株和其它相关标准毒株进行敏感性和特异性试验。结果与结论所建立的一步法多重RT-PCR具有较高的特异性和敏感性,与禽流感其它亚型和NDV、IBV、ARV?IBDV的核酸均无交叉反应。用该方法检测现场样品395份(4省20多个地区),结果与经典检测方法一致。

H5N1亚型禽流感病毒拯救体系的建立

选择鸡胚高产的鸭源H5N1亚型禽流感病毒A／Duck／Shandong／093／2004株作为骨架病毒，在完成了全基因组序列测定基础上，设计合成的11对引物对病毒的8个基因分11段进行扩增。通过与转录载体PHW2000连接，构建A／SD／04的8个基因的拯救载体，经测序获得序列准确的拯救质粒：241、242、243、244、245、246、247和248。A／SD／04的8质粒与PR8（H1N1）进行不同组合的拯救，获得8个均含A／SD／04HA基因的H5重组流感病毒。鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝效价在2^8-2^10，EID50在10^-8.5 - 10^-9之间，MDT在34～46h之间，均与野生A／SD／04（wt A／SD／04）相似。重组病毒对6周龄的SPF鸡的静脉接种指数（IVPI）与wt A／SD／04却有明显的差异，说明不同组合的内部基因影响病毒对鸡的致病力，但不影响病毒的鸡胚致死能力、对鸡胚的感染能力和病毒在鸡胚中的繁殖能力。构建的A／SD／04的8个质粒拯救系统，为H5NI的基因功能研究和新型疫苗开发奠定基础。

H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株的全基因克隆及序列分析

应用流感病毒通用引物[4]和H5N1亚型禽流感(Avian influenza virus,AIV)的型特异性引物,成功的扩增出H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株(简称A/D/SD/04)的全基因序列(包括5′和3′端的非编码区序列).A/D/SD/04的基因组核苷酸全序列与18株网上公布的禽流感基因序列进行比较和分析,结果与4株鸭源H5N1的5～7个基因具99%以上的同源性;与14株H5N1有至少一个以上内部基因同源性在95%以上.与H9亚型AIV代表株A/Quail/Hongkong/G1/97(简称G1株)和A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)比较,除了非结构基因(Nonstructural gene,NS)与G1株的同源性为95.3%外,其余基因均在36.6%～92.1%之间.说明A/D/SD/04没有H9N2基因的直接整合,是H5N1毒株在自然界的重组株.推导的HA氨基酸序列分析,A/D/SD/04 的血凝素(Heamgglutinin,HA)裂解位点与比较的16株AIV的序列一致,是高致病性禽流感的分子特征(PQRERRRKKR/G),第226位氨基酸是对禽类和哺乳细胞均具有亲嗜性的蛋氨酸(Met).神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)在第48位氨基酸(颈部)后有20个氨基酸的缺失,但非结构蛋白(NS)没有在79～84氨基酸发生缺失.碱性聚合酶2(PB2)的627位氨基酸是亲禽类细胞的谷氨酸(Glu,E).结合生物学特性和分子特征,A/D/SD/04对小鼠的致病力是由多种因素决定,其可能是一株对鸡高度致病,并逐渐获得对哺乳动物致病能力的中间重组病毒.

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

A/goose/Guangdong/1/96(GSGD/1/96)是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒,它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株,而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染成功拯救了该病毒(R-GSGD/1/96)。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性,即对鸡都是高致病性毒株,R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10;救获病毒与野生病毒一样,尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2d内能从肺脏检测到低滴度的病毒,但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。

云南边境禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因分子结构特征分析

目的分析2003-2008年云南边境禽流感H5N1亚型病毒血凝素(HA)基因分子结构特征。方法对2003-2008年在云南边境采集境外禽类样品420份,做H5/N1亚型特异性RT-PCR及多重RT-PCR检测,对阳性样品中H5N1病毒HA基因进行RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及系统发育分析。结果21份代表性病毒样品HA裂解位点序列存在4种不同排列方式,均具有高致病性禽流感病毒分子结构特征;HA受体结合位点、糖基化位点及表位关键性氨基酸位点存在变异;系统发育分析表明可划分为5个不同进化分枝(1、2.4、2.3.2、2.3.4、7)。结论2003-2008年云南边境外H5N1病毒间具有遗传差异,进化分枝2.3.4毒株为当地流行的优势毒株,不同进化分枝或同一进化分枝不同毒株HA基因存在变异。

神经氨酸酶茎部氨基酸缺失对H5N1亚型禽流感病毒生物学特性的影响

近年来H5N1亚型禽流感病毒（AIV）神经氨酸酶（NA）茎部15—20个氨基酸的自发缺失时有报道，突变对于AIV生物学特性的影响还没有得到系统研究。应用反向遗传操作技术，拯救获得5株具有不同NA茎部长度的H5N1／PR8重组AIV。重组病毒的内部基因和血凝素（HA）基因来源相同，NA基因来源不同，并在NA茎部进行20个氨基酸的删除或添加突变。通过研究其生物学特性发现，5株重组病毒在SPF鸡胚中繁殖良好，其EID50、MDT和平均病毒滴度相似；NA茎部长短影响病毒的解凝能力，长茎病毒红细胞解脱能力比短茎病毒强；NA茎部15或20个氨基酸删除突变提高了重组病毒在MDCK细胞上的繁殖能力，短茎病毒释放出的病毒粒子数量是长茎病毒的10。100倍，释放时间提前6．10h，短茎病毒在MDCK细胞上形成的空斑也明显比长茎病毒的空斑大。实验结果揭示了AIVNA茎部氨基酸缺失突变的生物学意义，NA茎部15或20个氨基酸删除突变增强了AIV的细胞适应性，可能与现阶段H5N1亚型AIV宿主范围进一步扩大有关。利用反向遗传技术成功拯救了5株H5N1／PR8重组流感病毒，为流感病毒基因功能研究和重组疫苗研究建立了技术平台。通过对AIVNA茎部氨基酸的删除突变提高了病毒在MDCK细胞上的繁殖产量，为流感病毒细胞苗的生产提供了新的思路。