美国奶牛H5N1亚型高致病性禽流感疫情形势与研究进展

自2024年3月25日美国确认首例奶牛H5N1亚型高致病性禽流感病例以来,疫情不断蔓延,不但引发了大范围奶牛之间的传播,还跨物种传播到多种哺乳动物和奶牛从业人员,引发全球广泛关注。本文梳理总结了当前美国奶牛疫情的流行现状以及病毒来源、传播途径,病毒基因组和流行病学特征,人工感染试验以及巴氏杀菌对病毒的灭活效果等研究进展,以期为该病的风险防范提供重要参考。

2024年美国奶牛H5N1亚型高致病性禽流感疫情分析

2024年3月以来,美国报告了多例奶牛H5N1亚型高致病性禽流感病例,引发全球广泛关注。本文对本次疫情进行了系统梳理,分析了疫情流行情况和分布规律,提出了风险防范建议。现有数据表明,引发奶牛感染的H5N1亚型高致病性禽流感病毒属于2.3.4.4b分支,与美国同期在家禽和野禽中流行的毒株高度同源。初步分析表明,感染奶牛的病毒可能来源于野生候鸟。疫情发生后,美国采取了限制移动、调运检测等综合防控措施。本次疫情可能对美国奶牛产业造成一定程度的负面影响,但从目前来看对我国影响较小。建议持续进行国外疫情监视,国内加强野禽风险监测,强化家禽强制免疫,积极宣传引导,做好应急储备等,降低本次疫情对我国的影响。

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

A/goose/Guangdong/1/96(GSGD/1/96)是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒,它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株,而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染成功拯救了该病毒(R-GSGD/1/96)。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性,即对鸡都是高致病性毒株,R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10;救获病毒与野生病毒一样,尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2d内能从肺脏检测到低滴度的病毒,但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。

H5N1亚型禽流感病毒NS第263~277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义，构建H5N1A／D／SD／04株HA、NA、NS的全基因表达／转录载体，以及NS的删除突变载体（m248），A/D/YZ/04株的NS基因表达／转录载体（848）和其补加15个核苷酸的NS突变载体（m848）。构建的载体分别与编码WSN（H1N1）内部基因载体进行组合转染，拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒：RWSN-848和RWSN—m248在263-277位缺失15个碱基。RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价（HA）、鸡胚的平均死亡时间（MDT）和鸡胚半数感染量（EID50）均无显著差异；但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN—m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263～277位核苷酸发生缺失后，不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能，但提高了病毒对鸡的致病力。

高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学表现特点

目的探讨高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学检查方法及胸部X线与CT影像表现特点。方法回顾性分析2006年6月深圳接诊的首例由卫生部确诊,并经过抢救治疗痊愈的高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎患者的相关临床及影像学资料。结果胸部影像学特点是:①磨玻璃样影、大小片状影及肺实变影是人禽流感病毒性肺炎较早出现的影像表现;②病灶侵犯肺组织广泛,表现为多叶多段的两肺广泛受累;③病灶蔓延变化迅速;④肺实质、肺间质及胸膜受累可同时存在;⑤病灶吸收慢、迁延时间长,恢复期有肺纤维化的影像表现。结论影像学检查与诊断仍然是人禽流感病毒性肺炎的临床诊断、鉴别诊断、疗效评价及预后分析的重要手段。动态观察人禽流感病毒性肺炎的影像学变化及影像学表现特点,监测ARDS和肺部继发感染等并发症的发生,利于指导临床及时有效地进行治疗。

1株H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的细胞凋亡观察

TUNEL染色法和透射电镜观察表明,鸭静脉接种或眼-鼻-口腔-泄殖腔混合接种高致病力禽流感病毒A/duck/Guangdong/220/2004(H5N1)后,心、肝、脾、肺、肾、胰、肠、脑、胸腺和法氏囊均可发生细胞凋亡。其中,凋亡主要发生在胰腺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞、肝细胞和肠黏膜上皮细胞;也有少量神经元、神经胶质细胞、心肌细胞、呼吸毛细管上皮细胞,胸腺、脾脏和法氏囊淋巴细胞发生凋亡。

一例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)的流行病学调查

目的通过对1例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)的调查分析,为制定人禽流感预防控制措施提供科学依据。方法采用流行病学调查、临床检查、血清学检查和 RT-PCR、 Real-time PCR 法进行分析和诊断。结果发现1例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1),经救治无效因呼吸衰竭死亡。患者有明确的病、死禽接触史。采用隔离治疗、个人防护、医学观察、消毒等措施,疫情得到控制,未出现二代病例。结论需加强禽流感疫情监测,采取综合防控措施,预防疫情再次发生。

1株H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的抗原定位观察

通过对鸭静脉接种或眼-鼻-口腔-泄殖腔接种禽流感病毒A/duck/Guangdong/220/2004(H5N1)后,采用免疫组织化学方法检查病毒核蛋白抗原,探讨了该病毒在组织器官中的定位与分布。结果表明,病毒核蛋白抗原主要存在于鸭的心肌细胞、肝细胞、枯否氏细胞、胰腺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和血液吞噬性白细胞;在气管和支气管黏膜上皮,脑组织,肠黏膜上皮,胸腺、法氏囊、脾脏和肺脏的巨噬细胞或组织细胞以及坏死的细胞碎片中也可检查到少量病毒核蛋白抗原;而在食管、胃、睾丸、卵巢、甲状腺、肾上腺、哈德氏腺、骨骼肌等未检查到该抗原。

应对高致病性禽流感病毒H5N1抗原漂移的通用疫苗策略

高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1不仅能造成严重的病理损伤,而且能够跨越种间隔离从禽类直接传播给人类,对人类健康造成巨大的威胁。疫苗免疫是应对HPAIV H5N1最常用的防控手段。但由于流感病毒具有抗原漂移和抗原转变的能力,只针对特定流行株的常规疫苗不能够有效的应对毒株的不断变异。研制能够激发广泛保护作用的通用疫苗是应对HPAIV H5N1抗原漂移的一种有力措施,该类疫苗以流感病毒中高度保守的蛋白结构域,如M2蛋白胞外域(M2e)、HA蛋白的茎部结构域以及其他的保守抗原表位为免疫原,激发机体产生广泛的保护以应对不断变异的流感病毒。论文主要对现阶段通用疫苗的研究思路及进展做一梳理,以期能够为禽流感疫苗的研制提供有益的帮助。

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。

1株对小鼠呈高致病性H5N1亚型禽流感病毒的遴选

目的观察从死禽体内分离的禽流感H5N1病毒株对小鼠的致病情况,筛选一株可用于小鼠攻毒实验的H5N1毒株。方法将17株禽源H5N1病毒分别滴鼻感染6～8周龄Balb/c小鼠,观察其对小鼠的致病和致死情况。通过测定其中毒力较强一株的EID_(50)、TCID_(50)、小鼠LD_(50)及濒死小鼠不同组织中病毒载量,判定其致病力;采用遗传进化分析绘制HA基因进化树,了解其进化特征。结果动物实验表明,17株高致病性禽源H5N1毒株中,仅有一株对小鼠为高致病性。该毒株TCID_(50)/100μl=7.2,EID_(50)/100μl=8.325,小鼠1 LD_(50)/100μl=6.318≈10~2EID_(50)。鼻粘膜感染4～6 d小鼠发病,表现为精神萎靡、食欲减退、竖毛、弓背等临床症状,体重明显减轻。小鼠死亡集中在发病后的2～5 d,耐过死亡者12 d完全恢复正常。从濒死感染小鼠脾、肺、鼻及脑组织中皆可检出流感病毒NS片段,病毒数载量以脑组织中最多,达3.56×10^(10)拷贝/5μl。结论筛选到一株对小鼠呈强致病性H5N1亚型禽流感毒株,可以用于禽流感疫苗交叉保护效果评价的小鼠攻击实验,也可以作为感染模型用于H5N1禽流感病毒致病机制的研究。

人感染高致病性禽流感病毒A/Fujian/1/2007(H5N1)株基因组序列测定及分析

目的对福建省分离的高致病性禽流感病毒A/Fujian/1/2007(H5N1)株进行全基因组序列测定,了解病毒序列及进化特征。方法SPF鸡胚分离法分离A/Fujian/1/2007(H5N1)株病毒,并提取病毒RNA。病毒RNA经通用引物逆转录后,应用特异性引物分别扩增病毒各节段,产物经TA克隆到载体中进行测序并对结果进行排列、拼接成完整的病毒基因组。分析病毒重要位点特征,并参照已发表的病毒序列,对A/Fujian/1/2007(H5N1)株作系统进化分析。结果应用自行设计的引物,扩增并获得完整的A/Fujian/1/2007(H5N1)株基因组序列。病毒重要位点的分析表明,该株病毒为禽源高致病性禽流感病毒,病毒对达菲敏感而对金刚烷胺类药物则具有耐药性。病毒特征有待进一步的生物学验证。系统进化分析显示,在亚洲各国引起人类感染的高致病性禽流感病毒具有明显的地理分布特征,A/Fujian/1/2007(H5N1)病毒与国内以往毒株属同一进化分支。结论获得人感染高致病性禽流感病毒A/Fujian/1/2007株全基因组序列,了解病毒重要的氨基酸位点特征以及亚洲人感染病毒间的亲缘关系,为进一步探讨福建省禽流感病毒变异、传播机制等奠定基础。

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及免疫原性

用昆虫杆状病毒表达系统表达了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,HA蛋白表达分子量约为70 ku;将HA蛋白制成油乳液,免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,收集血清,以血凝抑制试验(HI)和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)评估体液免疫,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评估细胞免疫。试验结果表明:重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组免疫小鼠后,血清中和抗体效价及ELISA IgG效价均显著高于PBS组,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。ELISPOT试验数据显示,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组小鼠脾单个核细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞数量显著高于PBS组,而重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。用昆虫杆状病毒表达系统表达H5N1 HA蛋白制成油乳液能诱导体液免疫和细胞免疫,能为预防高致病性禽流感H5N1候选疫苗的筛选提供依据。

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达

目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达。方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因。HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过CellfectinⅡ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达。分别用SDS-PAGE、Western blot、血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定。结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000。血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集。质谱分析鉴定该重组蛋白为HA蛋白。结论:重组HA蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础。

中国高致病禽流感A/H5N1病毒感染控制专家建议

自1997年中国香港确诊第一例A／H5N1人禽流感病例以来，目前已有中国、越南、印度尼西亚、泰国、土耳其、吉布提、阿塞拜疆、埃及、缅甸、柬埔寨、巴基斯坦、伊拉克、尼日利亚、老挝和孟加拉国等15个国家发生了人禽流感病例。按照中华人民共和国《传染病防治法》规定，人感染高致病性禽流感应该按照甲类传染病管理。

贵州省第2例高致病性禽流感A/H5N1病毒感染患者体外膜肺氧合的护理

高致病性禽流感A／H5N1病毒感染（简称人禽流感）一其临床特点表现为流行病学不典型、散在发病、发现晚、病情重、进展快、病死率高的特点，全球已确诊病例共582例，其中343例死亡；截至2012年1月5日，中国内地已确诊41例，其中27例死亡。

新发高致病性禽流感H5N1病毒的致病性、传播力研究及进化分析

目的对2011年底导致香港红嘴鸥死亡、并与深圳死亡患者分离株高度同源的新发高致病性禽流感H5N1病毒的致病性及传播力进行预警,同时对其序列进行遗传进化分析。方法对新发H5N1病毒进行感染性评价,证实其是否确实具有在人类细胞中增殖的能力,并对新发毒株在细胞及小鼠中的感染性进行评价,并对其在小鼠群体中的传播力进行研究。同时,还基于HA蛋白序列对新发病毒进行遗传分析,确定其进化地位。结果新发H5N1病毒在体外对人源肺细胞具有一定程度的感染性,对小鼠的致病性相比目前毒力最强H5N1毒株及WHO推荐的禽流感疫苗制备株较弱,可在小鼠群体间进行有效传播,但诱发机体体液免疫保护程度较弱。结论新病毒进化地位属于Clade 2.3.2.1,为近年来的国内主流流行株,其进化的过程中暂未发生导致致病性增强的正向选择事件。

两株H5N1高致病性禽流感病毒对小鼠的致病力研究

为比较2株H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)对哺乳动物的致病力,本研究选取了A/Anhui/2/05(AH/2/05)和A/Sichuan/81/05(SC/81/05)两株病毒,采用低剂量(10 EID50)感染小鼠模型,并就两株病毒对小鼠的致病力差异进行检测。结果表明AH/2/05感染后小鼠出现体重下降和神经症状,并可致死部分小鼠;SC/81/05感染小鼠后,小鼠无任何明显的症状,体重、食欲、精神状态均不受影响。AH/2/05感染后病毒可在小鼠的全身复制,病毒在小鼠体内的存活时间可以长达14 d。SC/81/05感染后病毒仅在小鼠的肺脏中复制,并且仅能够在感染后的3 d和5 d分离到病毒。病理学检测显示,AH/2/05感染后病毒存在于小鼠的各脏器细胞并且引起小鼠脏器组织的严重病理变化,而SC/81/05感染后并未对小鼠组织脏器造成明显的病理变化。本研究结果揭示了人源和禽源H5N1禽流感病毒低剂量感染对小鼠的致病差异,同时为进一步研究H5N1亚型HPAIV在哺乳动物中的感染和致病能力提供了相关的实验依据。

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/Guangxi/53/02株感染性克隆的构建

A/Duck/Guangxi/53/02(DKGX)是从我国南方健康鸭体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒,该病毒对鸡具有高致病性,而且能感染哺乳动物模型Balb/c小鼠,但不致死小鼠(MLD50>106.5)。本试验根据GenBank上的序列DKGX/53/02设计了8对引物,建立了对DKGX的8质粒反向遗传操作系统,并通过细胞转染技术成功拯救了R-DKGX。R-DKGX在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野生毒(W-DKGX,MLD50>106.5)一致的生物学特性,即106EID50鼻腔感染小鼠后3 d均只能在肺脏检测到病毒,病毒含量分别为(3.22±0.51)lgEID50/mL和(3.69±0.88)lgEID50/mL,MLD50>106.5。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。