人感染高致病性H5N6禽流感病毒的分子生物学特征

目的分析2014-2015年3例新型人感染高致病性禽流感（HPAI）H5N6毒株的血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）基因序列,探讨该病毒的遗传变异及分子生物学特征。方法收集Gen Bank、全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）及浙江大学传染病诊治国家重点实验室提供的H5N6病毒基因序列,利用生物信息软件MEGA6.0及Net Nglyc服务器对基因序列进行遗传进化和分子变异特征分析。结果 3例感染HPAI-H5N6患者毒株的HA与NA氨基酸序列的同源性分别为96.5%～98.7%和90.1%～98.2%;HA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014（H5N6）和A/Sichuan/26221/2014（H5N6）与A/duck/Eastern China/1111/2011（H5N2）同源性最近,分别为97.7%和98.5%;A/Yunnan/0127/2015（H5N6）与A/muscovy duck/Vietnam/LBM631/2014（H5N1）同源性最近（97.2%）;NA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014（H5N6）和A/Yunnan/0127/2015（H5N6）与A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）同源性最近,分别为97.2%和97.6%,A/Sichuan/26221/2014（H5N6）与A/duck/Guangdong/S3073/2010（H6N6）同源性最近（97.4%）;进化树分析显示3例患者毒株处于2个不同的分支;HA基因包含有S137A、T160A等突变,糖基化分析显示有6～7个N-糖基化位点。结论新型人感染HPAI-H5N6病毒是一种重组病毒,其HA基因来源于亚洲禽类H5亚型,NA基因来源于亚洲禽类H6N6;HA基因位点突变及N-糖基化改变可能有助于增强对人类的感染。

H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10^(-5),NA基因检测的灵敏度为10^(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID50)为10-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD50)为10-4.0/0.2mL,对小鼠的LD50为10-4.67/0.05mL。以106 EID50/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7d死亡,感染后第7天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×105 EID50/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。

多重荧光定量RT-PCR检测高致病性H5N6禽流感病毒

目的建立一种快速检测流感病毒A型(FluA)及高致病性禽流感(HPAI)H5N6病毒感染的荧光定量RT-PCR法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RP)基因作为临床样本的内参基因,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针,建立一种检测FluA及HPAI-H5N6病毒的一步法多重荧光定量RT-PCR方法,评估其灵敏度、特异性,并与上海之江公司提供的试剂及测序法进行比较。结果建立的多重荧光定量RT-PCR法检测FluA、H5、N6及RP质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L。各对引物和相应探针仅检测出相应的病毒,在这些病毒和常见病原分析中未发现存在交叉反应,特异性达100%。用该法检测135例临床标本,结果显示FluA为23例,未发现HPAI-H5N6病毒的感染者;与上海之江公司提供的试剂的检测结果及基因测序结果一致。结论建立的一步法多重荧光定量RT-PCR法可用于FluA及HPAI-H5N6病毒感染患者的早期诊断。

奥司他韦对高致病性H5N6亚型禽流感病毒的抑制效果评价

近年来,屡见高致病性H5N6禽流感病毒由禽跨种感染人及其他哺乳动物类的报道。而临床用药的盲目性导致其预后不良,本试验以评价流感病毒NA抑制剂奥司他韦是否能够有效抑制该病毒为试验目的。通过构建H5N6小鼠感染模型、制定奥司他韦治疗方式及药物用量以评价奥司他韦对H5N6流行株的抑制作用。通过存活率分析,预防+治疗组奥司他韦对H5N6有较好预防效果,而单纯治疗组小鼠存活率只达50%。通过肺组织中病毒含量结果显示在攻毒第12日未能检测到病毒,而治疗组滴度下降至2.500×log10 EID50/0.1mL(*P<0.01)。由此可见,奥司他韦对H5N6亚型禽流感小鼠适应株有较好的预防效果,对于攻毒后再治疗可一定程度抑制病毒的复制。

中国鸭源H5N6 AIV血凝素和神经氨酸酶基因特征及遗传进化分析

为明确中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因特征及其遗传变异情况,研究选取了NCBI流感病毒资源库里的32株具有完整ORF编码区的中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因序列,利用分子生物学软件分析其HA和NA基因特征及其遗传进化情况。结果显示,中国鸭源H5N6 AIV的HA裂解位点有REKRRKR↓G、RERRRKR↓G和KEKRRKR↓G三种类型,HA有6个潜在的N-糖基化位点,其中第182、222、224位氨基酸依次为N、Q、G,具有与禽源唾液酸α-2,3受体结合的特性,然而HA发生了S123P/T、T156A、S223R氨基酸位点突变,部分毒株发生了I151T氨基酸位点突变;HA基因核苷酸遗传进化分析显示,中国鸭源H5N6 AIV遗传进化上均处于clade2.3.4.4分支,并进一步进化出Ⅰ和Ⅱ两个亚分支。部分中国鸭源H5N6 AIV NA第59~69位缺失11个氨基酸,中国鸭源H5N6 AIV NA基因遗传进化上分为两个大的分支,分别对应NA基因颈部缺失型和完整型两种类型;NA颈部完整型的NA有6个潜在的N-糖基化位点,NA颈部缺失型的NA由于第59~69位氨基酸的缺失,导致其第67位丢失了一个N-糖基化位点。研究为中国鸭源H5N6 AIV的生物学特性和遗传进化特征研究奠定基础。

深圳市H5N6、H7N9流感病毒NA-UTR序列特征

目的分析深圳市H5N6、H7N9流感病毒神经氨酸酶(NA)基因非翻译区(UTR)的分子特性,为进一步探究NA基因与流感病毒转录复制及包装之间的关系奠定理论基础。方法使用MEGA 7.0、DNAstar7.1.0等生物信息分析软件对全球和深圳H5N6、H7N9流感病毒NA的UTR进行核苷酸序列同源性分析及基因多态性分析。结果 2014-2015年深圳市H5N6病毒与其他HXN6病毒株比较,NA-3′端核苷酸同源性为95.1%~100.0%,H5N6-NA 3′-UTR高度保守;5′端UTR核苷酸同源性为89.7%~100.0%,H5N6-NA 5′-UTR主要在第23、27、29及33位发生突变。8株2013-2014年深圳市H7N9病毒与其他HXN9流感病毒株比较,NA-5′端UTR核苷酸同源性为93.3%~100.0%,其在第4、6及23位发生突变。结论深圳市人感染H5N6及H7N9病毒NA-UTR的保守区具有高度同源性,其可变区具有基因多态性。

四种常用消毒剂对H5N6亚型禽流感病毒灭活效果的研究

为了比较常用消毒剂对HSN6亚型禽流感病毒（avian influenzavirus，AIV）的杀灭效果，依照《消毒技术规范》，评估聚维酮碘溶液、过硫酸氢钾复合物粉、戊二醛癸甲溴铵溶液、稀戊二醛溶液这4种消毒剂在不同浓度下分别与H5N6亚型AIV作用10、30和60min的灭活效果。结果显示，0．5％（m／V）聚维酮碘溶液作用10min，0．2％（m／V）过硫酸氢钾复合物粉溶液作用10min，0．2％（V/V）戊二醛癸甲溴铵溶液作用30min或0．5％（WV）稀戊二醛溶液作用10min，均可将H5N6亚型AIV完全灭活。与推荐使用浓度相比．稀戊二醛溶液、聚维酮碘、戊二醛癸甲溴铵溶液均可以有效灭活H5N6亚型AIV。而过硫酸氢钾复合物粉不能有效灭活H5N6亚型AIV。本研究为H5N6亚型AIV消毒标准的建立提供了参考。

H5N6禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR的建立与应用

目的 建立H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR,用于疑似病例快速诊断及活禽交易市场外环境监测.方法 根据GenBank中H5N6禽流感病毒HA和NA高保守序列设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化双重实时荧光RT-PCR体系,进行特异性、灵敏度、重复性试验,并在临床应用中与商品化试剂盒比较.结果 H5N6双重实时荧光RT-PCR体系可在80 min内完成检测,与其它亚型流感病毒及常见呼吸道病原体无交叉反应,最低检测限达到10拷贝/反应,H5和N6靶基因标准曲线的相关系数R2分别为0.999和0.993,Ct值的变异系数分别为0.151％-0.549％和0.213％-0.575％,验证试验的阳性和阴性符合率均为100％.结论 H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR特异、灵敏、稳定,可在疑似病例的早期快速应急检测及活禽交易市场外环境持续性监测方面具有较好的应用价值.

深圳市H5N6、H7N9流感病毒HA-UTR基因分子特征分析

目的 了解深圳市H5N6、H7 N9流感病毒HA基因非翻译区（Untranslated region,UTR）的分子特征.方法 使用MEGA7.0、DNAStar7.1.0等生物信息学分析软件对全球及深圳H5N6、H7N9流感病毒HA基因的UTR进行核苷酸序列同源性分析及基因多态性分析.结果 3株2014-2015年深圳市H5N6病毒与其他H5NX病毒株比较,HA-3＇UTR核苷酸同源性为77.4％-100％,H5N6-HA-3＇UTR未见明显突变位点;HA-5＇UTR核苷酸同源性为91.7％ - 100％,H5N6-HA-5＇UTR第24、31位发生突变.11株2013-2014年深圳市H7N9病毒与其他H7NX病毒株比较,HA-5＇UTR核苷酸同源性为81.2％ -100％,H7N9-HA-5＇UTR在第2-6、9、10、12及15 - 17位发生多位点突变.结论 深圳市人感染H5N6及H7N9病毒HA的UTR保守区高度同源性及其可变区具有基因多态性.

低温环境对常用消毒剂灭活禽流感病毒的影响

为研究低温环境对常用化学消毒剂杀灭禽流感病毒的影响,依照《消毒技术规范》,评估过硫酸氢钾复合物、二氯异氰脲酸钠、戊二醛癸甲溴铵、癸甲溴铵和戊二醛苯扎溴铵5种消毒剂在低温(4℃)和常温(25℃)环境下对当前我国流行的H5N6亚型高致病性禽流感病毒的杀灭效果。结果显示,与常温环境下相比,二氯异氰脲酸钠和过硫酸氢钾复合物受低温影响较小;戊二醛癸甲溴铵与戊二醛苯扎溴铵的作用浓度需提高2倍方可杀灭H5N6亚型高致病性禽流感病毒,而癸甲溴铵的作用浓度需提高4倍。戊二醛癸甲溴铵需要将使用浓度在最大推荐浓度基础上再提高至少2.5倍方可杀灭病毒,而其他消毒剂提升浓度均在最大推荐浓度以内。本研究对我国养禽场及活禽交易市场在低温环境下合理选用针对禽流感病毒的消毒剂提供了参考。

家禽粪便环境对常用消毒剂灭活H5N6亚型禽流感病毒的影响

为了研究家禽粪便环境对常用化学消毒剂杀灭H5N6亚型禽流感病毒的影响,依照《消毒技术规范》,评估5种消毒剂在粪便环境下对目前我国流行的H5N6亚型高致病性禽流感病毒的杀灭效果。结果:与无粪便环境组相比,家禽粪便对5种消毒剂的消毒效果均造成一定程度的影响,需要提高消毒剂工作浓度。其中:过硫酸氢钾复合物溶液、二氯异氰脲酸钠溶液、戊二醛苯扎溴铵溶液作用浓度需分别提高2.5倍、2倍和4倍(均在说明书最大推荐浓度范围内),方可完全灭活H5N6亚型禽流感病毒。尽管癸甲溴铵溶液与戊二醛癸甲溴铵溶液作用浓度分别需提高8倍和4倍可完全杀灭病毒,但均超出了说明书最大推荐浓度,具有一定的使用风险。本研究对指导养禽场和活禽交易市场在粪便环境下科学合理地使用消毒剂杀灭禽流感病毒提供了参考。

山东省H5N6禽流感病毒血凝素与神经氨酸酶基因序列分析

目的分析2015—2017年从环境中分离到的4株H5N6禽流感病毒毒株的血凝素(hemaglutinin,HA)与神经氨酸酶(neuramindase,NA)基因序列,探讨该病毒的遗传变异及分子生物学特征.方法对检测到的H5亚型禽流感病毒开展病毒分离、基因测序,利用MEGA 6.0对基因序列进行遗传进化和分子变异特征分析.结果山东省分离到的H5N6亚型HA、NA基因同源性分别为94.6%~99.4%和95.4%~98.6%;进化分析显示,其HA基因属于2.3.4.4支,分属于2个不同的分支.氨基酸序列分析显示HA和NA均存在多个位点的变异,糖基化分析显示有4~8个N-糖基化位点.结论H5N6病毒具备对禽类高致病的分子特征,但不具有感染人的受体结合特征.

H5N6亚型禽流感的流行特点与防控要点

H5N6亚型禽流感病毒(AIV)于2013年在我国家禽中首次出现,2014年报道H5N6亚型AIV感染人案例,同年H5N6亚型取代H5N1亚型成为优势毒株,也是目前我国家禽中主要流行的血清亚型之一。H5N6亚型禽流感疫情不仅对家禽养殖业造成巨大经济损失,同时也对公共健康构成重大威胁,现对H5N6亚型AIV的病原学、致病性、传播途径以及国内外H5N6亚型AIV的流行特点进行综述,并提出防控措施建议,以期为H5N6亚型AIV的预防控制提供理论基础,保障公共卫生安全。

2021年3—4月全球主要疫情回顾

本刊对2021年3—4月全球重点传染病疫情(截至4月25日)汇总如下。1全球新冠疫情4月份反弹,印度疫情急剧恶化2021年1月全球新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎)每日新增病例数达到50万~60万例,2月以后增速放缓,每日新增病例数降到30万~40万例,但3月以后每日新增病例数又持续上升,4月中旬开始以每日新增70万~80万例的速度继续上升,达到了新型冠状病毒肺炎疫情(新冠疫情)发生以来的峰值。见图1。