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H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化
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作者 屈小天 王雅楠 +4 位作者 许倩茹 李雪洋 张申立 张二芹 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第3期125-132,共8页
为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将... 为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。 展开更多
关键词 h5N1亚型禽流感病毒 hA蛋白 水稻胚乳表达 蛋白质纯化
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广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选
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作者 李孟 谢芝勋 +7 位作者 李丹 徐倩 罗思思 张民秀 谢丽基 黄超 沈前程 黄娇玲 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期243-252,共10页
【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择1... 【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。 展开更多
关键词 禽流感病毒(AIV) h9N2亚型 油乳灭活疫苗 抗原相关性 疫苗交叉保护
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H3亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 毛秋艳 周淑宁 +9 位作者 刘朔 彭程 尹馨 张雅馨 周婉婷 李金平 侯广宇 蒋文明 宋厚辉 刘华雷 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1137-1146,共10页
H3亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染宿主广泛,具备跨物种传播的能力,不但造成了家禽的发病,还导致了多起人感染病例,具有重要的公共卫生意义。因此,有必要建立一种快速灵敏的H3亚型AIV的检测方法。本研究参考了GenBank近... H3亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染宿主广泛,具备跨物种传播的能力,不但造成了家禽的发病,还导致了多起人感染病例,具有重要的公共卫生意义。因此,有必要建立一种快速灵敏的H3亚型AIV的检测方法。本研究参考了GenBank近年来公开的H3亚型AIV HA基因序列,在保守区域设计一对特异性引物和Taq Man探针。通过对反应条件的优化,分别以cRNA阳性标准品和病毒核酸标准品为模板绘制标准曲线,建立了针对H3亚型AIV的荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性进行评估。进一步使用实验室攻毒鸡组织样品和临床拭子样品对该方法进行了验证。结果表明,该方法特异性强,与其他亚型AIV和常见禽类病原体均无交叉反应;检测下限分别为1.0×10^(2) copies·μL^(-1)和10^(2) EID 50·0.1 mL^(-1),灵敏度与常规RT-PCR相比提高了10倍;组内和组间变异系数均小于1.5%,重复性较好。动物攻毒临床试验样品和临床拭子样品检测结果显示,该检测方法敏感性高于普通RT-PCR方法,与病毒分离鉴定结果一致,符合率为100%,可用于临床检测。综上,本研究建立的H3亚型AIV荧光定量RT-PCR检测方法具备特异、快速、灵敏等特点,为H3亚型AIV的快速诊断和监测及防控提供一定的技术支持。 展开更多
关键词 禽流感病毒 h3亚型 荧光定量 监测
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共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价
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作者 吕亚迪 杨洁 +2 位作者 谢文婷 徐婷 陈瑞爱 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2123-2134,共12页
旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF... 旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。 展开更多
关键词 h9N2亚型禽流感病毒 hA蛋白 新城疫病毒 免疫原性 载体疫苗 免疫保护效率
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6株H9N2亚型禽流感病毒分子特征及遗传演化分析
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作者 邢燕茹 祝宇翔 +2 位作者 范春燕 于海 汪秀会 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第2期89-97,共9页
为了解H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的分子变化特征及其跨物种传播的可能性,对实验室保存的6株H9N2亚型AIV的8个基因片段进行了序列测定及遗传演化分析,并且对6株病毒与选取的代表毒株进行了HA和NA同源性及关键氨基... 为了解H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的分子变化特征及其跨物种传播的可能性,对实验室保存的6株H9N2亚型AIV的8个基因片段进行了序列测定及遗传演化分析,并且对6株病毒与选取的代表毒株进行了HA和NA同源性及关键氨基酸位点分析。结果显示,分离的6株病毒均为欧亚系,其中3株为G57基因型;4株病毒的HA蛋白发生了Q226L突变,2株病毒的HA发生了A190V突变。HA和NA均有增加或缺失的潜在糖基化位点。6株病毒的NA茎部均有62~64位的缺失,红细胞结合位点431~433较为保守,而368和369位变化较大。综上,6株病毒为低致病性AIV,HA和NA均含有哺乳动物适应性突变,增大了其跨宿主传播的风险。研究结果为我国H9N2亚型AIV的进化提供了参考依据,为其综合防控提供了理论指导。 展开更多
关键词 禽流感病毒 h9N2亚型 分子特征 遗传进化
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鸽H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及致病性试验
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作者 贺祥 徐久鹏 +5 位作者 袁嘉欣 卢佳慧 范雨欣 常伽翌 李龙飞 徐彤 《北方牧业》 2024年第12期15-15,共1页
H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流... H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流感病毒时有报道,这其中包括H5N1、H7N9以及H9N2亚型禽流感病毒。虽然H9N2亚型禽流感毒株的致病性相对于H5和H7亚型较低,但是该亚型病毒在我国家禽中存在较为普遍,且目前从鸽子已分离到重组的H9N2毒株,该毒株不仅引起鸽子感染而且具有优先与人类呼吸道表面受体结合的能力,因此加强流感病毒在鸽群中流行情况具有重要的现实意义。 展开更多
关键词 h9N2亚型禽流感病毒 A型流感病毒 感染现象 公共卫生学 致病性试验 h7亚型 h5N1 健康养殖
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2018—2022年我国H5亚型禽流感的流行特点及防控
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作者 尤博文 陈禧悦 +1 位作者 廖明 代曼曼 《中国家禽》 北大核心 2024年第1期90-96,共7页
H5亚型高致病性禽流感在我国频繁发生,对我国养禽业造成严重危害,同时亦对我国公共卫生带来了巨大挑战。近年来,随着H5亚型禽流感病毒的不断进化,其在我国的流行情况也发生了一定变化。文章对2018年1月—2022年11月我国暴发的H5亚型禽... H5亚型高致病性禽流感在我国频繁发生,对我国养禽业造成严重危害,同时亦对我国公共卫生带来了巨大挑战。近年来,随着H5亚型禽流感病毒的不断进化,其在我国的流行情况也发生了一定变化。文章对2018年1月—2022年11月我国暴发的H5亚型禽流感相关公共数据进行分析,并结合血清学和病原学的监测数据,阐述了H5亚型禽流感病毒传播与进化过程、流行情况和特点,以期为我国H5亚型禽流感的防控提供理论依据。 展开更多
关键词 h5亚型禽流感 流行特点 防控
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2020—2022年全球H5亚型高致病性禽流感疫情简况及分析
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作者 王慧强 张跃 +3 位作者 程敏姮 殷雨晴 郑雪莹 李志军 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第7期34-40,共7页
为了解近年全球H5亚型高致病性禽流感(HPAI)疫情具体情况,本文通过对农业农村部畜牧兽医局发布的“一周国际动物疫情动态”和“疫情发布”中的HPAI疫情信息进行统计和分析,对2020—2022年全球H5亚型HPAI疫情的发生和流行情况,空间、时... 为了解近年全球H5亚型高致病性禽流感(HPAI)疫情具体情况,本文通过对农业农村部畜牧兽医局发布的“一周国际动物疫情动态”和“疫情发布”中的HPAI疫情信息进行统计和分析,对2020—2022年全球H5亚型HPAI疫情的发生和流行情况,空间、时间和群间分布,以及给养禽业造成的危害进行较为全面的了解。结果显示,2020年全球H5亚型HPAI疫情以H5N8亚型为主;自2021年5月份,呈现H5N1亚型疫情逐渐增多、H5N8亚型疫情逐渐减少的趋势,至11月份,形成以H5N1亚型疫情为主、H5N8亚型疫情零星发生的局面。H5N1亚型HPAI疫情逐渐演变为全球大流行,在欧洲形成“重灾区”,非洲和亚洲疫情也较为严重。2022年存在2次明显的H5亚型HPAI跨洲际传播,分别是2月份从欧洲传播到北美洲和10月份从北美洲传播到南美洲,经分析认为这2次跨洲际传播与候鸟迁徙有密切联系。结果表明,本轮H5N1亚型HPAI疫情全球大流行持续时间长、传播范围广,给世界养禽业造成巨大危害和深远影响。 展开更多
关键词 全球 h5亚型高致病性禽流感 疫情分析
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H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达
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作者 王粲 张民秀 +6 位作者 谢芝勋 李孟 罗思思 李丹 阮志华 谢丽基 谢志勤 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期103-110,共8页
为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Ba... 为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒 h9N2亚型 M1蛋白 NA蛋白 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
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空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究
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作者 廖思雨 郑新 +4 位作者 戴琪 许诗怡 张天旭 张秀桥 桂春 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期759-769,共11页
[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETA... [目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。 展开更多
关键词 空心莲子草乙酸乙酯部位(AETAC) h9N2亚型禽流感病毒(AIV-h9N2) DF-1细胞 鸡胚
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H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒的构建
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作者 王粲 张民秀 +6 位作者 谢芝勋 李孟 罗思思 李丹 阮志华 谢丽基 谢志勤 《中国兽药杂志》 2024年第7期1-12,共12页
为构建H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒,以血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neurami-nidase,NA)及基质蛋白(Matrix protein,M1)3种蛋白为对象,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了2种重组杆状病毒,即rBV-HA-M1和rBV-NA,用IFA和Wes... 为构建H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒,以血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neurami-nidase,NA)及基质蛋白(Matrix protein,M1)3种蛋白为对象,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了2种重组杆状病毒,即rBV-HA-M1和rBV-NA,用IFA和Western-blot鉴定重组蛋白的免疫活性,再将rBV-HA-M1和rBV-NA以最佳感染复数比例共感染昆虫Sf9细胞,经浓缩后获得病毒样颗粒,同时进行血凝滴度测定和透射电镜观察。透射电镜观察结果显示,表达的HA-M1和NA重组蛋白可以在Sf9细胞中自组装形成病毒样颗粒,浓缩的病毒样颗粒能够凝集1%的鸡红细胞,血凝效价为1∶64。试验结果为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒病毒样颗粒疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒 h9N2亚型 病毒样颗粒 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
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重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗免疫黄鸡抗体水平分析
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作者 黄青 杨建德 刘燕霏 《天津农学院学报》 CAS 2024年第3期59-62,共4页
H5或H7亚型高致病性禽流感是一种高度致死性传染病,它不仅给养禽业造成了巨大的危害和损失,还威胁着人类的生命健康安全。为了分析重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株和H7N9 H7-Re3株)免疫抗体水平,本研究对... H5或H7亚型高致病性禽流感是一种高度致死性传染病,它不仅给养禽业造成了巨大的危害和损失,还威胁着人类的生命健康安全。为了分析重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株和H7N9 H7-Re3株)免疫抗体水平,本研究对如皋市内14个养殖场近2万只黄鸡进行重组禽流感病毒三价灭活疫苗肌肉注射,免疫三周后,随机采集420份血液样品进行HI抗体效价检测。结果表明,免疫后的鸡群均无明显不良反应,可以诱导黄鸡产生良好的抗体,检测时具有较高的抗体效价,H5亚型Re-11株平均抗体效价为7.8log2,Re-12株平均抗体效价为8.2log2,H7亚型Re-3株的平均抗体效价为6.8log2,并且免疫抗体合格率均达到70%以上,对黄鸡具有良好的安全性和免疫保护效果,研究结果为有效地控制高致病性禽流感提供参考依据。 展开更多
关键词 重组禽流感病毒 h5+h7亚型 三价灭活疫苗 免疫 抗体水平
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2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒分子特征和遗传进化分析
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作者 吴晶晶 陈宏彬 +3 位作者 林琦 张炎华 鄢育青 翁育伟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期750-757,共8页
目的分析2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒的分子特征和遗传进化特点,为禽流感防控提供参考依据。方法对2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型单阳性标本进行复核,筛选出Ct值小于30的标本,对HA和NA基因进行靶向扩增和二代测序... 目的分析2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒的分子特征和遗传进化特点,为禽流感防控提供参考依据。方法对2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型单阳性标本进行复核,筛选出Ct值小于30的标本,对HA和NA基因进行靶向扩增和二代测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,使用生物信息学软件分别对HA和NA基因进行分子突变位点和遗传进化分析。结果共完成12株H5亚型HA和NA全基因测序。序列比对结果显示,HA基因最高一致性在98.59%~99.89%,NA基因最高一致性在98.19%~99.85%。遗传进化分析显示,HA基因归属于Clade 2.3.4.4h分支,NA基因归属于欧亚谱系H5N6和H6N6分支。12株毒株的裂解位点均为高致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点为禽源受体,但S123P、S133A、I151T、T156A突变可增强病毒与人源受体的亲和力。HA基因糖基化位点分析显示,常见154位糖基化位点缺失,在124位(-NHTS)新增潜在糖基化位点。结论2018-2019年福建省禽类外环境中存在Clade 2.3.4.4h进化分支H5N6高致病性禽流感病毒,并且N6基因在进化上具有多样性,提示基因进化重组的可能,需加强对病毒分子进化的持续监测。 展开更多
关键词 禽流感病毒 h5N6亚型 遗传进化 变异
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HA和NA匹配度对H5亚型高致病性禽流感假病毒影响的研究
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作者 李涵冰 李树东 +4 位作者 常小艳 杨学莲 侯喜林 王桂芹 余丽芸 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期665-671,共7页
为研究不同H5亚型高致病性禽流感病毒(H5 HPAIV)的HA和NA匹配度对流感假病毒组装和功能的影响,本研究将5株H5 HPAIV的HA和NA基因节段分别克隆于pCMV/R载体,构建3个HA和5个NA重组质粒,两两随机组合后将HA、NA质粒与pCMV/RΔ8.9质粒、p HR... 为研究不同H5亚型高致病性禽流感病毒(H5 HPAIV)的HA和NA匹配度对流感假病毒组装和功能的影响,本研究将5株H5 HPAIV的HA和NA基因节段分别克隆于pCMV/R载体,构建3个HA和5个NA重组质粒,两两随机组合后将HA、NA质粒与pCMV/RΔ8.9质粒、p HR-CMV-Luc质粒构成4质粒系统,利用磷酸钙法将4个质粒转染HEK293T细胞,检测各细胞培养上清液血凝效价,结果显示:有3个上清液无血凝效价,其余12个上清液的血凝效价在100 HAU/m L~400 HAU/m L,表明获得12株具有血凝效价的流感假病毒。超速离心后获得浓缩假病毒,通过western blot检测假病毒HA蛋白的表达,结果显示各假病毒均在75 ku、50 ku和25 ku有特异性条带。利用各假病毒分别感染MDCK.1细胞60 h后裂解细胞,采用荧光素酶试验检测假病毒的相对荧光素酶活性(RLA),结果显示各假病毒RLA在5.0×10~1~4.5×10~5不等。上述结果首次表明不同H5 HPAIV的HA和NA相互匹配会对假病毒的血凝效价和相对荧光酶活性(RLA)造成影响。本研究为后续流感病毒灭活疫苗制备及抗病毒药物的研发奠定基础。 展开更多
关键词 h5亚型高致病性禽流感病毒 病毒 hA NA
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不同分子生物学方法在H5亚型禽流感病毒检测中的应用比较
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作者 尚佳静 罗娟 +8 位作者 于晓慧 房立春 亓丽红 孟鸽 封莹洁 蒋文明 刘华雷 刘冠慧 李阳 《中国动物检疫》 CAS 2023年第11期100-106,共7页
H5亚型高致病性禽流感(H5-HPAI)是严重危害家禽养殖业和公共卫生健康的一类动物疫病,也是我国高度重视、严格防控的人兽共患病。目前常用检测H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)的分子生物学技术包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量P... H5亚型高致病性禽流感(H5-HPAI)是严重危害家禽养殖业和公共卫生健康的一类动物疫病,也是我国高度重视、严格防控的人兽共患病。目前常用检测H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)的分子生物学技术包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、反转录重组酶辅助扩增(RT-RAA)、RT-RAA结合侧流层析试纸条(RT-RAA-LFD)、RT-RAA-簇状规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白结合侧流层析试纸条(RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD)等。为比较不同检测方法对H5-AIV检测的灵敏度差异,将制备的cRNA标准品进行倍比稀释,分别用RT-PCR、RT-qPCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD、RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD进行检测。结果显示:RT-PCR、RT-qPCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD与RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD方法的检测灵敏度分别为10^(2)、10^(-1)、10^(0)、10^(0)、10^(-1)copies/μL。与RT-qPCR相比,RT-PCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD、RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD在临床样本检测上具有较高的符合率,分别为85.00%、93.75%、88.75%、91.25%。结果表明,5种方法均对H5-AIV具有良好的检出率,但RT-qPCR与RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD灵敏度更高,分别适合在实验室与基层养殖场进行临床检测。本研究评估了不同方法在H5-AIV检测中的应用效果,为在不同场景下选择准确可靠的检测方法提供了参考,也为H5-AIV感染的防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 禽流感病毒 h5亚型 检测方法 灵敏度
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H5亚型禽流感病毒HA蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达与纯化
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作者 刘郁夫 陈晓洁 +3 位作者 区炳明 容芳 郝文茜 陈瑞爱 《动物医学进展》 北大核心 2023年第10期19-24,共6页
为表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-HA重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组HA基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表... 为表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-HA重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组HA基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表达的HA蛋白进行鉴定。结果表明表达的重组HA蛋白均能与抗Strep标签抗体、H5亚型禽流感病毒阳性血清(Re-11株)特异性结合,且HA重组蛋白在昆虫细胞中以细胞分泌上清的形式表达,红细胞凝集效价为1∶64,利用链霉素亲和层析的方法,纯化重组HA蛋白,纯化后HA蛋白浓度为0.364 mg/mL。试验结果可为禽流感病毒亚单位疫苗研制、HA蛋白单克隆抗体制备提供前期基础。 展开更多
关键词 h5亚型禽流感病毒 hA蛋白 杆状病毒 蛋白表达
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近期全球哺乳动物及人类H5亚型高致病性禽流感疫情风险预警 被引量:3
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作者 孙映雪 宋建德 +2 位作者 张秀娟 王梦瑶 郑雪光 《中国动物检疫》 CAS 2023年第10期1-5,共5页
根据世界动物卫生组织(WOAH)数据库和世界卫生组织(WHO)通报数据,2020年至2023年上半年,H5亚型高致病性禽流感病毒已在25个国家引发310起哺乳动物疫情和70例人间病例,动物感染疫情和人间病例分布于欧洲、亚洲、美洲和非洲,感染动物包括... 根据世界动物卫生组织(WOAH)数据库和世界卫生组织(WHO)通报数据,2020年至2023年上半年,H5亚型高致病性禽流感病毒已在25个国家引发310起哺乳动物疫情和70例人间病例,动物感染疫情和人间病例分布于欧洲、亚洲、美洲和非洲,感染动物包括家养犬猫以及赤狐、狼等多种陆生哺乳动物,也包括海狮、海豹等海洋哺乳动物,且动物感染疫情仍在持续发展。本文对报告的动物疫情和人间病例,从地理、时间、NA亚型和动物种类分布等方面进行了统计分析,并提出了风险预警和管理建议,以期为我国做好应急预案提供数据和理论支持。 展开更多
关键词 禽流感 h5亚型 哺乳动物 风险分析 预警
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H7亚型禽流感病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用 被引量:2
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作者 蒋文明 李金平 +6 位作者 尹馨 彭程 刘朔 李阳 于晓慧 王静静 刘华雷 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第2期39-43,共5页
为了建立灵敏、特异的H7亚型禽流感病毒(AIV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本研究根据GenBank和GISAID中H7亚型AIV血凝素(HA)基因的核苷酸序列,设计合成H7亚型AIV的引物和探针,对反应条件进行优化,从而建立检测H7亚型AIV的ddPCR方法,... 为了建立灵敏、特异的H7亚型禽流感病毒(AIV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本研究根据GenBank和GISAID中H7亚型AIV血凝素(HA)基因的核苷酸序列,设计合成H7亚型AIV的引物和探针,对反应条件进行优化,从而建立检测H7亚型AIV的ddPCR方法,并测定其特异性、敏感性和重复性。结果显示,最佳引物浓度和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃,最佳升降温速率为2.0℃/s,最佳反转录时间为20 min。特异性试验结果显示,该方法仅对H7亚型AIV进行特异性检测,对H5亚型AIV、H9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均不能检出。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品检测下限为0.8 copies/μL,比荧光定量PCR(qPCR)方法敏感性高10倍。组内和组间重复性试验结果显示,变异系数均小于3%。对60份临床样品检测显示,该方法与鸡胚分离方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的H7亚型AIV ddPCR检测方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于H7亚型AIV的早期诊断、流行病学调查、诊断方法评估、标准物质研制、免疫效果评估,为H7亚型AIV的科学防控和研究提供了有力的技术储备。 展开更多
关键词 禽流感病毒 h7亚型 数字PCR
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H5N2亚型禽流感病毒分离鉴定与鸡致病性研究
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作者 范航 路卫星 邵国宾 《北方牧业》 2023年第15期13-13,共1页
禽流感是由A型禽流感病毒引起的,多种家禽及野生禽类发病的一种高度接触性传染病,又称为“真性鸡瘟”或“亚洲鸡瘟”,其表现形式是多种多样的,有的只能通过检出抗体和分离病毒才能确诊感染疾病。在本研究中,从患有禽流感病史的鸡中,分... 禽流感是由A型禽流感病毒引起的,多种家禽及野生禽类发病的一种高度接触性传染病,又称为“真性鸡瘟”或“亚洲鸡瘟”,其表现形式是多种多样的,有的只能通过检出抗体和分离病毒才能确诊感染疾病。在本研究中,从患有禽流感病史的鸡中,分离出了一株H5N2亚型禽流感病毒,导致鸡胚半数感染量以及致死量居高不下,因此研究H5N2亚型禽流感病毒的分离和鉴定,以及其对鸡的致病性,这对于我国禽类养殖中能有效防控禽流感具有重大的意义。 展开更多
关键词 h5N2亚型禽流感病毒 分离 鉴定 鸡致病性
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新型水禽用三价禽流感病毒载体疫苗可有效阻断H5和H7亚型禽流感病毒感染与传播
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作者 ZHAO YU-BO CHEN PU-CHENG HU YU-ZHEN 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1093-1093,共1页
2020年以来,H5亚型高致病性禽流感病毒先后在欧洲出现,并在欧洲引发大规模疫情,随后通过野鸟迁徙传入非洲、亚洲及北美多个国家,引起更大规模的疫情暴发。据世界动物卫生组织(WOAH)统计,新型H5N8和H5N1病毒在全球已累计导致约3亿多只家... 2020年以来,H5亚型高致病性禽流感病毒先后在欧洲出现,并在欧洲引发大规模疫情,随后通过野鸟迁徙传入非洲、亚洲及北美多个国家,引起更大规模的疫情暴发。据世界动物卫生组织(WOAH)统计,新型H5N8和H5N1病毒在全球已累计导致约3亿多只家禽死亡或被扑杀,给养禽业造成了巨大损失。此次禽流感疫情导致大量家禽死亡或被扑杀,部分国家出现了“鸡蛋荒”。 展开更多
关键词 世界动物卫生组织 高致病性禽流感病毒 禽流感 养禽业 h7亚型禽流感病毒 h5亚型 病毒载体疫苗 扑杀
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