H6亚型禽流感病毒的分离鉴定与生物学特性分析

为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。

2016-2018年广州市H6亚型禽流感病毒外环境分离株HA基因遗传特征分析

目的对广州禽类市场外环境H6亚型禽流感病毒进行分离和测序,分析HA基因遗传进化特点。方法通过接种鸡胚分离H6亚型禽流感病毒,采用RT-PCR方法扩增HA基因全长序列并测序,通过DNA Star7.1和MEGA 4.0软件,分析HA基因遗传特征。结果2016-2018年广州禽类市场外环境分离到6株H6亚型禽流感病毒,HA基因核苷酸同源性在81.0%~99.1%之间。基因序列特征分析显示,所有分离株裂解位点序列相对保守,只有1个碱性氨基酸插入,呈现低致病性禽流感病毒分子特点。受体结合位点均为226Q和228G,为禽类呼吸道上皮受体结合位点。2016年分离株发现183-NNT糖基化位点的缺失。进化分析显示,广州早期分离株属于广东常见的ST2853-like分支,但2018年监测发现了ST339-like新流行分支病毒。结论广州地区H6亚型禽流感病毒尚为禽类低致病性病毒,本研究毒株HA基因变异较大,2018年毒株出现多遗传分支进化趋势,因此需要继续监测H6亚型禽流感病毒的流行和变异。

检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

为建立快速检测H6亚型禽流感病毒的血清学方法,试验利用前期制备的两株抗H6亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体,建立检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法,并进行特异性、灵敏度、稳定性试验以及对活禽市场采集的48份咽拭子样品的检测效果。结果显示:该ELISA方法只与H6亚型禽流感病毒反应,而与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H12等其他亚型禽流感病毒,血清4型禽腺病毒、血清8b型禽腺病毒、血清3型鸭腺病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、传染性法氏囊病病毒以及禽白血病病毒均无交叉反应;该ELSIA方法可检测2.32×10^(4)TCID50/mLH6亚型禽流感病毒,批间和批内重复试验变异系数均小于10%;该ELISA方法和RT-PCR方法对活禽市场采集的48份咽拭子样品检测结果一致,进一步检测攻毒鸡的咽拭子显示该方法可有效检测咽拭子中H6亚型禽流感病毒。研究表明,基于两株单克隆抗体建立的检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,适用于H6亚型禽流感病毒感染的临床检测。

黄芩苷对自噬介导H6N6禽流感病毒致病损伤的作用

探究黄芩苷对H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏致病损伤的作用。选用40只昆明小鼠随机分为4组,即对照组、模型组、黄芩苷治疗组、3-MA抑制剂组。通过HE染色观察肺组织病理形态学变化,ELISA法检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α的含量,透射电镜检测小鼠肺脏中自噬体的水平,Western blot检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG7蛋白表达水平,免疫荧光法检测肺组织LC3蛋白表达水平,免疫组化法检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG5蛋白表达水平,RT-qPCR检测肺组织自噬关键基因LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平。结果显示,经黄芩苷治疗后能显著缓解H6N6亚型禽流感病毒对小鼠肺组织的损伤,血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α含量显著下降(P<0.01),肺组织中自噬体数量减少,LC3、Beclin-1、ATG5及ATG7蛋白表达水平显著下降(P<0.01),肺组织中LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平显著下降(P<0.01)。结果表明,黄芩苷能减轻H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏炎症损伤,同时下调自噬关键因子及自噬体的水平,提示其抗小鼠肺损伤机制可能与调控细胞自噬有关。

H6亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立一种快速、敏感、特异的检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据H6亚型AIV血凝素(HA)基因序列的保守区8个位点设计了6条特异性LAMP引物,以H6亚型AIV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,对反应条件和反应体系进行优化。结果表明该方法的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应。该方法灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01 pg,该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法。

两株H6亚型禽流感病毒变异株的生物学特性分析

目的研究两株H6亚型禽流感病毒变异株对小鼠的致病性,并建立H6亚型禽流感病毒变异株感染BALB/c小鼠动物模型,为病毒的致病机理、抗病毒药物研究及其疫苗评价提供实验平台。方法 106EID50/50μl～101EID50/50μl病毒经鼻内接种小鼠,在攻毒后第3、5d分别剖杀小鼠,无菌取脏器,分析病毒在不同时间不同脏器的复制水平,观察小鼠临床症状、脏器的病毒滴定水平,小鼠体重变化情况及生存率,评估变异株病毒对小鼠的易感性和致病性,同时对肺脏进行病理学检查和免疫组化分析。结果与亲代毒株相比较,小鼠感染两变异株后体重明显下降直至死亡,组织滴定显示病毒不仅能在肺和鼻甲骨复制,还能入侵小鼠的脑组织。免疫组化显示感染后小鼠肺脏有变异株病毒分布。结论经小鼠肺脏传代获得的2株H6亚型禽流感病毒变异株对小鼠具有易感性和致病性。建立的小鼠动物模型可用于H6亚型禽流感病毒致病机制、感染特点、病毒疫苗的研制及药物效果的评价。

A/H6N1亚型禽流感病毒致病性评估及与2009 A/H1N1亚型流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性

目的探讨人、禽流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性,为下一步研究H6亚型禽流感病毒重配和致病性变异的分子机制奠定基础。方法野鸭源A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007以101EID50～106EID50的攻毒剂量经鼻内途径感染小鼠,通过临床症状观察、病毒滴定和病理切片观察进行病毒学和组织学两方面检测对小鼠的致病性;同时,将此病毒与2009年A/H1N1流感病毒A/Changchun/01/2009(H1N1)混合感染豚鼠,分析两株病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性。每天采集豚鼠鼻洗液并用噬斑纯化技术获得重配病毒,对获得的重配病毒进行全基因组序列的测定。结果 H6N1亚型禽流感病毒能直接感染小鼠,但对小鼠不致死。106EID50的攻毒剂量可有效感染小鼠,攻毒后第5天,小鼠表现出被毛较粗乱、活动减少、体重下降、呼吸急促的临床症状,但至攻毒后第10天开始康复,而对照组(MOCK)小鼠在14 d的观察期内无明显临床症状。病毒滴定结果表明,该病毒主要在小鼠肺脏和鼻甲骨中复制,病毒滴度可达104.5EID50/mL。病理学观察发现感染小鼠肺泡壁增厚,有大量炎性细胞浸润,纤维蛋白渗出并伴有轻微出血;在A/H6N1和A/H1N1混合感染豚鼠的重配实验中,经过三轮噬斑纯化从豚鼠鼻洗液中分离到6株重配病毒,说明A/H6N1亚型禽流感病毒与A/H1N1亚型流感病毒具有很好的遗传兼容性,能在豚鼠体内能发生重配。结论野鸭源A/H6N1亚型流感病毒无需适应就能够感染哺乳动物;该病毒与A/H1N1流感病毒具有很好的遗传兼容性,在哺乳动物体内能够发生基因重配,产生新的重配病毒,其公共卫生意义应引起高度关注。

环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感监测

为了解环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感病毒的分布和流行情况,分别于2009—2011年对环洞庭湖地区活禽批发市场、2011—2013年对水禽场的H6亚型禽流感进行了系统监测。对在活禽批发市场上采集的拭子样品先由尿囊腔接种SPF鸡胚,然后用血凝试验(HA)测定所收集的尿囊液,对HA测定有滴度的再进行血凝抑制试验(HI),并与RT–PCT方法相结合鉴定病毒的亚型。检测结果显示:在环洞庭湖区的5个活禽批发市场上都分离到H6亚型禽流感,并且在鸡、鸭、鹅拭子中都分离到该病毒,总的分离率为6.49%;水禽场H6亚型禽流感病毒群体阳性率达3.6%,拭子的H6亚型病毒分离率为0.29%,活禽批发市场鸭拭子H6亚型禽流感病毒分离率为9.58%,表明市场环节水禽H6亚型禽流感的隐性带毒率比养殖环节高,在一定程度上说明禽流感在活禽批发市场存在水平传播的风险。

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID50)为10-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD50)为10-4.0/0.2mL,对小鼠的LD50为10-4.67/0.05mL。以106 EID50/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7d死亡,感染后第7天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×105 EID50/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。

H6N6亚型禽流感病毒进化演变及跨种属传播研究进展

H6N6亚型禽流感病毒(AVI)在欧亚大陆野生鸟类和家禽中广泛流行,通过适应性突变和基因重配,其宿主范围逐渐扩大,遗传分析表明该病毒是高致病禽流感病毒H5N6的先祖之一.近年来研究证实,H6N6亚型AIV可以感染小鼠、雪雕、猪等哺乳动物,甚至在健康人群中检测到H6亚型AIV的血清特异性抗体,表明H6N6亚型禽流感病毒具有跨越物种屏障感染哺乳动物的能力,并对人类健康构成潜在威胁.本文从H6N6病毒起源、流行情况、进化演变及跨种属传播的研究进展进行综述,以期为H6N6亚型AIV的防控提供参考.

H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10^(-5),NA基因检测的灵敏度为10^(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。

低温环境对常用消毒剂灭活禽流感病毒的影响

为研究低温环境对常用化学消毒剂杀灭禽流感病毒的影响,依照《消毒技术规范》,评估过硫酸氢钾复合物、二氯异氰脲酸钠、戊二醛癸甲溴铵、癸甲溴铵和戊二醛苯扎溴铵5种消毒剂在低温(4℃)和常温(25℃)环境下对当前我国流行的H5N6亚型高致病性禽流感病毒的杀灭效果。结果显示,与常温环境下相比,二氯异氰脲酸钠和过硫酸氢钾复合物受低温影响较小;戊二醛癸甲溴铵与戊二醛苯扎溴铵的作用浓度需提高2倍方可杀灭H5N6亚型高致病性禽流感病毒,而癸甲溴铵的作用浓度需提高4倍。戊二醛癸甲溴铵需要将使用浓度在最大推荐浓度基础上再提高至少2.5倍方可杀灭病毒,而其他消毒剂提升浓度均在最大推荐浓度以内。本研究对我国养禽场及活禽交易市场在低温环境下合理选用针对禽流感病毒的消毒剂提供了参考。

四种常用消毒剂对H5N6亚型禽流感病毒灭活效果的研究

为了比较常用消毒剂对HSN6亚型禽流感病毒（avian influenzavirus，AIV）的杀灭效果，依照《消毒技术规范》，评估聚维酮碘溶液、过硫酸氢钾复合物粉、戊二醛癸甲溴铵溶液、稀戊二醛溶液这4种消毒剂在不同浓度下分别与H5N6亚型AIV作用10、30和60min的灭活效果。结果显示，0．5％（m／V）聚维酮碘溶液作用10min，0．2％（m／V）过硫酸氢钾复合物粉溶液作用10min，0．2％（V/V）戊二醛癸甲溴铵溶液作用30min或0．5％（WV）稀戊二醛溶液作用10min，均可将H5N6亚型AIV完全灭活。与推荐使用浓度相比．稀戊二醛溶液、聚维酮碘、戊二醛癸甲溴铵溶液均可以有效灭活H5N6亚型AIV。而过硫酸氢钾复合物粉不能有效灭活H5N6亚型AIV。本研究为H5N6亚型AIV消毒标准的建立提供了参考。

中国鸭源H5N6 AIV血凝素和神经氨酸酶基因特征及遗传进化分析

为明确中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因特征及其遗传变异情况,研究选取了NCBI流感病毒资源库里的32株具有完整ORF编码区的中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因序列,利用分子生物学软件分析其HA和NA基因特征及其遗传进化情况。结果显示,中国鸭源H5N6 AIV的HA裂解位点有REKRRKR↓G、RERRRKR↓G和KEKRRKR↓G三种类型,HA有6个潜在的N-糖基化位点,其中第182、222、224位氨基酸依次为N、Q、G,具有与禽源唾液酸α-2,3受体结合的特性,然而HA发生了S123P/T、T156A、S223R氨基酸位点突变,部分毒株发生了I151T氨基酸位点突变;HA基因核苷酸遗传进化分析显示,中国鸭源H5N6 AIV遗传进化上均处于clade2.3.4.4分支,并进一步进化出Ⅰ和Ⅱ两个亚分支。部分中国鸭源H5N6 AIV NA第59~69位缺失11个氨基酸,中国鸭源H5N6 AIV NA基因遗传进化上分为两个大的分支,分别对应NA基因颈部缺失型和完整型两种类型;NA颈部完整型的NA有6个潜在的N-糖基化位点,NA颈部缺失型的NA由于第59~69位氨基酸的缺失,导致其第67位丢失了一个N-糖基化位点。研究为中国鸭源H5N6 AIV的生物学特性和遗传进化特征研究奠定基础。

家禽粪便环境对常用消毒剂灭活H5N6亚型禽流感病毒的影响

为了研究家禽粪便环境对常用化学消毒剂杀灭H5N6亚型禽流感病毒的影响,依照《消毒技术规范》,评估5种消毒剂在粪便环境下对目前我国流行的H5N6亚型高致病性禽流感病毒的杀灭效果。结果:与无粪便环境组相比,家禽粪便对5种消毒剂的消毒效果均造成一定程度的影响,需要提高消毒剂工作浓度。其中:过硫酸氢钾复合物溶液、二氯异氰脲酸钠溶液、戊二醛苯扎溴铵溶液作用浓度需分别提高2.5倍、2倍和4倍(均在说明书最大推荐浓度范围内),方可完全灭活H5N6亚型禽流感病毒。尽管癸甲溴铵溶液与戊二醛癸甲溴铵溶液作用浓度分别需提高8倍和4倍可完全杀灭病毒,但均超出了说明书最大推荐浓度,具有一定的使用风险。本研究对指导养禽场和活禽交易市场在粪便环境下科学合理地使用消毒剂杀灭禽流感病毒提供了参考。

1株鸭源H4N6亚型禽流感病毒的HA遗传进化分析及对动物的致病性分析

水禽源的H4N6病毒株能否感染鸡或者其他禽类,以及致病力如何尚未清楚,本研究利用2018年1月初从健康水禽监测样品中分离到的1株H4N6亚型AIV,命名为A/Duck/Henan/JM/2018(H4N6),对其HA基因遗传特点及对SPF鸡和樱桃谷鸭的感染特点进行了系统研究。试验结果显示,JM株的HA基因裂解位点为PEKASR I GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征,属于欧亚分支,与国内的H4N6毒株亲缘关系较近,表明该毒株的HA基因变异不大;JM株感染鸡和鸭后可通过消化道和呼吸道有效地向外界排毒,说明病毒可以在体内增殖,且有一定的水平传播能力,揭示病毒有跨宿主传播的可能。

H6亚型流感病毒在小鼠肺内的适应性传代研究

目的为了进一步探讨H6亚型禽流感病毒(AIV)对哺乳动物的感染与致病能力,建立H6亚型AIV哺乳动物感染模型。方法用H6N1亚型AIV感染BALB/c小鼠,并在小鼠肺组织中连续传代,测定病毒的EID50。观察感染鼠临床症状和体征,评价病毒的致病性。结果经8～9代的适应后,该病毒即对小鼠产生明显的致病性,小鼠表现出精神萎靡、食欲减退、竖毛、弓背等临床症状。测定鼠肺适应株病毒H6N1-P8-M1、H6N1-P9-M2、H6N1-P8-M3的EID50分别为108.5、106.75和108.25/ml,三毒株感染鼠在发作期全部死亡。H6N1-P0组小鼠感染后14d仍全部存活。结论 H6N1亚型AIV与其他亚型相似,同样具有经适应后对哺乳动物呈现高致病性的能力,提示应关注H6亚型AIV对人类的潜在风险,得到的毒力增强鼠肺适应株为H6N1流感病毒疫苗和药物研究以及致病分子机制研究提供了动物模型。

H5N6亚型禽流感的流行特点与防控要点

H5N6亚型禽流感病毒(AIV)于2013年在我国家禽中首次出现,2014年报道H5N6亚型AIV感染人案例,同年H5N6亚型取代H5N1亚型成为优势毒株,也是目前我国家禽中主要流行的血清亚型之一。H5N6亚型禽流感疫情不仅对家禽养殖业造成巨大经济损失,同时也对公共健康构成重大威胁,现对H5N6亚型AIV的病原学、致病性、传播途径以及国内外H5N6亚型AIV的流行特点进行综述,并提出防控措施建议,以期为H5N6亚型AIV的预防控制提供理论基础,保障公共卫生安全。