黄芩苷对自噬介导H6N6禽流感病毒致病损伤的作用

探究黄芩苷对H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏致病损伤的作用。选用40只昆明小鼠随机分为4组,即对照组、模型组、黄芩苷治疗组、3-MA抑制剂组。通过HE染色观察肺组织病理形态学变化,ELISA法检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α的含量,透射电镜检测小鼠肺脏中自噬体的水平,Western blot检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG7蛋白表达水平,免疫荧光法检测肺组织LC3蛋白表达水平,免疫组化法检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG5蛋白表达水平,RT-qPCR检测肺组织自噬关键基因LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平。结果显示,经黄芩苷治疗后能显著缓解H6N6亚型禽流感病毒对小鼠肺组织的损伤,血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α含量显著下降(P<0.01),肺组织中自噬体数量减少,LC3、Beclin-1、ATG5及ATG7蛋白表达水平显著下降(P<0.01),肺组织中LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平显著下降(P<0.01)。结果表明,黄芩苷能减轻H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏炎症损伤,同时下调自噬关键因子及自噬体的水平,提示其抗小鼠肺损伤机制可能与调控细胞自噬有关。

1株H6N6亚型禽流感病毒A/duck/Jiangsu/022/2009的全基因测序及遗传进化分析

目的对2009年分离自华东地区某活禽交易市场的1株国内未见报道的H6N6亚型禽流感病毒进行了全基因序列的测定,以探讨该病毒各基因片段的可能来源。方法通过常规的血清学试验确定病毒HA亚型,经RT-PCR方法扩增出各基因片段,连接到pGEM-Teasy载体上进行序列测定,利用BLAST进行序列的同源性分析,并结合GenBank中已收录的H6N6亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。结果 BLAST结果显示该H6N6病毒的HA基因与近年台湾分离株A/duck/Kingmen/E322/2004(H6N2)的核苷酸一致性最高(94.0%),推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-G,是典型低致病性禽流感病毒的特征序列;NA基因与华东地区分离株A/duck/EasternChina/160/2002(H4N6)的亲缘关系最近(核苷酸一致性91.0%);而PB1基因与荷兰2003年间分离的H7N7亚型流感病毒关系密切;PA基因则与1999-2000年间意大利分离的H7N1亚型流感病毒亲缘关系较近;NS1蛋白在第218位提前引入终止密码子致使C末端缺失13个氨基酸。结论国内首次分离到的H6N6亚型禽流感病毒的基因组构成较为复杂,但8个基因片段均属于欧亚系,与分离自北美地区的H6N6病毒的遗传距离较远,分别位于不同的进化分支。

广西鸭源H6N6亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

为了明确H6亚型禽流感病毒在广西地区的流行情况,广西自治区动物疫病预防控制中心从健康家鸭体内分离鉴定了一株H6N6亚型禽流感病毒A/duck/GX/038/2009(H6N6)(Dk/GX/038/09),对其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因进行了克隆和序列分析,并绘制了基因遗传进化树。结果显示,Dk/GX/038/09的HA和NA基因核苷酸与2005年广东鸭源H6N6亚型禽流感病毒的同源性最高,达97%;但其NA基因核苷酸与江苏2009年鸭源H6N6毒株同源性则较低,只有88.6%;Dk/GX/038/09与2005年从广东分离的多株鸭源H6N6禽流感病毒位于同一分支,具有较近的亲缘关系,而与2009年江苏分离H6N6鸭源禽流感病毒的亲缘关系相对较远。表明两广地区流行的H6N6毒株可能来自同一祖先病毒,这也许与两广地区禽类交易频繁相关;而与江苏H6N6毒株相应基因差异较大,表明当前我国流行的鸭源H6N6毒株存在一定的地域差异和明显的遗传多样性。

一株H6N6亚型野鸟禽流感病毒全基因组序列分析以及对小鼠的感染性研究

为进一步了解2015年分离于我国新疆野鸟粪便中的一株H6N6亚型禽流感病毒(AIV)A/WB/XJ/S1541/2015(H6N6)的生物学特性,本研究对其进行了全基因组测序、遗传演化分析以及BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析结果显示:该分离株HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为^(339)PQIETR↓GL^(346),仅有1个碱性氨基酸,具有低致病性AIV的分子特征。此外,分离株表面基因HA、NA均与一株H6N6亚型猪流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010高度同源,而内部基因均与H6N6亚型AIV A/pigeon/Guangxi/161/2014(H6N6)高度同源,提示该分离株基因来源的多样性。小鼠的感染性试验结果显示:该病毒可在小鼠的肺脏和鼻甲中有效复制,病毒滴度分别为5.33 log_(10) EID_(50)/mL、4.50 log10EID50/m L,提示其具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究结果为H6亚型AIV的持续性监测和相关生物学特性的研究奠定基础。

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的遗传进化及致病性分析

为了解H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的遗传进化及致病特点,本研究对一株从健康三穗鸭体内分离鉴定的H6N6亚型AIVA/Sansui Sheldrake Duck/Guizhou/013/2014(H6N6)进行部分生物学特性测定、全基因组测序与遗传进化分析及动物感染试验。结果表明:分离株的HA裂解位点"339PQIETRG345"为非连续性的碱性氨基酸,其MDT为98.4 h,ICPI为0.415,符合低致病性AIV的特征。BLAST结果显示该分离株HA基因与A/chicken/Hunan/S41912/2009(H6N2)的核苷酸同源性最高(97.1%);NA基因与A/duck/Eastern China/48/2010(H6N6)的一致性最高(97.0%);而PB2基因与A/muscovy duck/Vietnam/LBM755/2014(H5N6)的同源性达96.9%,M基因和NP基因则分别与A/duck/Jiangsu/4/2010(H3N6)和A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)同源性最高。动物感染试验结果表明,感染鸭不表现明显的临床症状,咽喉和泄殖腔不存在排毒现象;鸭子感染后的第3 d、5 d及7 d部分组织脏器中可以检测到病毒复制,但病毒含量并不高。以上研究结果表明,贵州省内分离到的H6N6亚型AIV是一株弱毒株,其基因组可能是由H6N2、H5N6、H3N6、H5N1等多个亚型病毒重组而成。

1株禽源猪流感H6N6病毒的反向遗传系统的建立

为建立禽源猪流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010(H6N6)的反向遗传系统,本试验构建了包含有GDK6毒株基因组的8个重组质粒,转染293T细胞后成功拯救出病毒r GDK6。救获病毒与亲本病毒拥有相同基因序列,其抗原性、经HI试验、TCID50试验和小鼠攻毒试验表明,救获病毒的生物学特性与对小鼠的致病性与亲本病毒一致。禽源猪流感H6N6病毒的反向遗传系统的成功建立为进一步研究H6亚型流感病毒的分子致病机理与病毒基因功能及新型疫苗创制提供了技术平台。

湖南省洞庭湖区5株H6N6亚型禽流感毒株HA、NA基因的遗传进化分析

为了从分子生物学角度了解H6N6亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律,为该地区H6N6亚型禽流感的防控提供一些理论依据,对2012年在洞庭湖区分离的H6N6亚型禽流感毒株的HA、NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的5株H6N6亚型禽流感毒株HA裂解位点为PQIETR↓GLF,均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒;5株病毒的HA和NA潜在的糖基化位点有一些差别,这些差别是否会引起其毒力和致病力上的差异还有待研究;从基因遗传进化关系来看,这些毒株与我国汕头、广西分离的毒株同源性较高。

1株H6N6亚型禽流感病毒贵州分离株HA和NA基因克隆与序列分析

为了解H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的流行情况,本研究对2014年从贵州省三穗鸭体内分离鉴定出的1株H6N6亚型AIV(A/duck/Guizhou/013/2014)HA和NA基因进行了克隆和序列分析。结果显示,A/duck/Guizhou/013/2014的HA基因与华东地区2009年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达97.5%,HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性AIV的分子特征;而NA基因则与福建2007年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达98.2%;由遗传进化树分析结果可知,HA和NA基因在遗传进化关系上,与湖南毒株位于同一分支,而与2007年贵州分离的3株H6N6亚型AIV不处于同一分支,说明A/duck/Guizhou/013/2014与本地区的H6N6亚型AIV亲缘关系较远。本研究结果表明当前贵州地区H6N6亚型AIV存在明显的遗传多样性。

H6N6亚型禽流感病毒广东分离株分子遗传演化分析

2010年至2011年在中国广东地区活禽交易市场进行流行病学调查时,在鸭咽和泄殖腔拭子中分离到2株H6N6亚型禽流感病毒,分别命名为A/Duck/Guangdong/C45/2010(H6N6)、A/Duck/Guangdong/C120/2011(H6N6)。应用RT-PCR分别对2株毒株的8个基因片段进行了克隆、测序与分析,结果表明:2毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,只有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒HA裂解位点附近的氨基酸序列特征;与2毒株HA基因相似性最高的毒株为A/Duck/Guangxi/GXd-5/2010(H6N1),与NA基因相似性最高的毒株分别为A/Duck/Fujian/3242/2007(H6N6)和A/Duck/Fujian/6159/2007(H6N6)。全基因组分子遗传演化分析表明,2毒株的8个基因片段均属于欧亚谱系的禽源演化分支;但HA基因属于ST2853-like分支,NP基因属于HN573-like分支,PB2、PB1、PA、M和NS基因属于ST339-like分支,说明本研究中的2株病毒为不同基因群间基因交换的重组病毒。因此,有必要加强H6亚型禽流感病毒流行病学调查以便及时关注其遗传变异与致病性进化,为中国禽流感的预防与控制提供数据支持和理论指导。

H6N6亚型禽流感病毒感染鸭免疫器官中3种细胞因子的表达变化

为探讨鸭感染H6N6亚型禽流感病毒(AIV)后对免疫器官中细胞因子IL-2、IL-10和IFN-α转录水平的影响,建立荧光定量PCR方法对胸腺、脾脏、法氏囊中的IL-2、IL-10和IFN-α3种细胞因子检测,研究非免疫鸭感染H6N6亚型AIV后1、3、5 d各细胞因子在免疫器官中的变化。结果显示,建立的荧光定量PCR方法标准曲线相关系数R~2为0.996~1.000,扩增效率为92.2%~93.6%,相关性较好,熔解曲线整齐单一,变异系数均小于9%,可用于后续试验;鸭在感染H6N6亚型AIV后的一定时间内免疫器官中的IL-2、IL-10和IFN-α呈现不同程度的转录水平变化,以及不同的细胞因子在不同组织之间的转录水平差异较大,其中IL-2在法氏囊中的转录水平比在胸腺和脾脏中变化明显较大;而IFN-α在胸腺和脾脏中的转录水平高于法氏囊;IL-10在免疫器官中转录水平较低。还发现H6N6亚型AIV感染鸭后免疫器官中的IL-2、IL-10、IFN-α转录水平在一定时间内为先上升后下降趋势,并且在感染后5 d降到最低。表明感染H6N6亚型AIV对鸭免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平有一定的影响。

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的基因组测序及遗传进化分析

对2016年分离自华东地区某活禽交易市场的一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒A/duck/Anhui/D0642/2016(H6N6)进行了全基因组序列扩增和测序,以及序列同源性比对和遗传进化分析。结果显示,该分离株的HA基因与野禽源病毒A/turtledove/Wuhan/HKBJ62/2015(H6N6)的核苷酸一致性最高,推导的裂解位点处氨基酸基序为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因无茎部缺失,与早期分离株A/duck/Fujian/6159/2007(H6N6)具有最高的核苷酸相似性;内部基因中,仅NP基因与H6N2亚型禽流感分离株的核苷酸相似性最高,PB2、PB1、PA、M和NS基因均与近几年的H6N6亚型病毒关系紧密。进一步的分析表明,D0642株的8个基因片段均属于欧亚进化谱系,可能由H6N6和H6N2亚型重组产生;并且NA和PB2基因还与当前国内优势流行的2.3.4.4分支H5N6亚型禽流感病毒关系密切,可以为其在自然界的进一步重组提供基因片段的来源。因此,须加强对H6亚型禽流感病毒的流行病学监测。

H6N6亚型禽流感病毒进化演变及跨种属传播研究进展

H6N6亚型禽流感病毒(AVI)在欧亚大陆野生鸟类和家禽中广泛流行,通过适应性突变和基因重配,其宿主范围逐渐扩大,遗传分析表明该病毒是高致病禽流感病毒H5N6的先祖之一.近年来研究证实,H6N6亚型AIV可以感染小鼠、雪雕、猪等哺乳动物,甚至在健康人群中检测到H6亚型AIV的血清特异性抗体,表明H6N6亚型禽流感病毒具有跨越物种屏障感染哺乳动物的能力,并对人类健康构成潜在威胁.本文从H6N6病毒起源、流行情况、进化演变及跨种属传播的研究进展进行综述,以期为H6N6亚型AIV的防控提供参考.

H6N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

为建立H6N6亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/GuangDong/S1311/10(W-CKGD)反向遗传操作系统,本研究构建了W-CKGD的8个重组质粒,拯救出AIV A/Chicken/GuangDong/S1311/10(R-CKGD)。全基因序列测定结果表明,救获病毒R-CKGD与野生病毒W-CKGD的核苷酸序列完全相同。R-CKGD与W-CKGD具有相同的受体结合特性和对BALB/c小鼠均呈低致病性,以106EID50剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒仅在小鼠的呼吸道复制,可以引起小鼠体重下降但均不造成死亡。实验结果表明,R-CKGD与W-CKGD保持了一致的生物学特性,从而为进一步研究H6亚型AIV的致病机理及跨宿主传播机制等提供了良好的平台。

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及对小鼠的感染性研究

为了解H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年在广东活禽交易市场分离的一株鸭源AIV DK/GD/S1182/2015(H6N6)进行了全基因组测序、遗传演化分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示,该病毒的HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸,符合低致病性AIV的分子特征;HA蛋白的222V和228S,可以增强病毒对α-2,6唾液酸受体的结合能力。NA蛋白颈部有11个氨基酸的缺失,这将会影响NA的神经氨酸酶活性;该病毒可能是2010年广东H6N6猪流感病毒与2014年广西AIV重组产生。小鼠感染性试验表明,该分离株不需要预先适应就能够在小鼠的肺脏内高效复制,提示该分离株具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究对H6亚型AIV监测和相关生物学特性研究具有一定的指导作用。

1株H6N6亚型禽流感病毒分子遗传特性分析

本研究采用无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡胚,从某活禽市场环境中分离出1株H6N6亚型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/zj18/2013,en/zj18)。通过二代测序技术进行全基因组测序,通过BLASTn进行同源性检索,并采用MEGA5.0软件构建系统发生树。基因进化树分析表明,分离株en/zj18的所有8个基因节段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)均与近年来中国华东地区流行的H6N6亚型禽流感病毒的相应基因位于同一进化分支,与参考株的核苷酸同源性达96.7%~99.6%。分离株en/zj18的HA蛋白裂解位点为PQIETR↓GL,是低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白上关键受体结合位点190和228位(按H3亚型的HA蛋白序列排序)氨基酸分别是E和G,理论上更易与α2,3-半乳糖苷唾液酸受体结合。结果提示,需加强活禽市场禽流感病毒的持续监测,从而为有效应对禽流感病毒对公共卫生的持续威胁提供科学依据。

水禽H6N6亚型禽流感病毒在猪和人的肺组织中的复制能力的体外研究

目的研究水禽H6N6亚型禽流感病毒(AIV)在体外猪和人的肺组织中的复制能力。方法选取两株分离自鸭或鹅的H6N6亚型AIV(A/DK/GX/750/2010和A/GS/GX/399/2010),行基因测序和遗传进化分析了解其基因来源。将每株病毒分别体外接种于猪肺和人肺组织,接种后24 h、48 h、72 h收集组织,取组织匀浆液和培养上清液在10 d鸡胚中分离培养病毒,并行苏木精-伊红染色观察组织病理改变,采用免疫组化法检测病毒核蛋白的表达。结果基因进化分析显示H6N6亚型AIV A/DK/GX/750/2010、A/GS/GX/399/2010属于欧亚谱系的Group-Ⅱ(ST2853-like),为同一重配病毒的不同变型。两株H6N6亚型AIV体外接种于猪肺和人肺组织后,组织匀浆液和培养上清液中均可分离到病毒,免疫组化检测提示病毒核蛋白呈阳性,其主要表达在肺泡细胞和肺泡巨噬细胞,苏木精-伊红染色显示肺组织内出现肺泡细胞坏死和肺泡破坏,人肺组织还伴有炎性细胞浸润。结论水禽H6N6亚型AIV能在体外猪和人的肺组织中有效地复制,提示该病毒具有感染哺乳动物猪及人类的潜能,必须密切监测其流行及进化演变情况,以防止其感染人类。

一株三穗鸭源H6N6亚型禽流感病毒的分离鉴定

探讨H6N6亚型禽流感病毒在鸭群中的流行状况,为贵州省流感疫情动态监测及防控提供依据。从贵州三穗县某养鸭殖场采集50份泄殖腔棉拭子,处理后经过绒毛尿囊腔接种9日龄非免疫鸡胚,通过血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)分离到1株既不是新城疫病毒,也不是H5、H7和H9亚型禽流感的病毒;提取病毒RNA,通过禽流感病毒HA和NA基因通用引物扩增得到相应的HA和NA基因片段。经过测序比对分析证实所分离病毒为H6N6亚型禽流感病毒。贵州鸭群中存在H6N6亚型禽流感病毒,为进一步研究其起源和致病性提供了重要依据。

鸡源禽流感病毒H6N6亚型在猪呼吸道组织的复制及其基因特点

目的:探讨H6N6亚型禽流感病毒(AIV)是否跨种间屏障传播感染猪及其基因特点。方法:将3株鸡源性H6N6亚型AIV体外感染猪呼吸道组织,观察病毒在猪呼吸道组织复制及其病理变化,同时应用基因测序法,比较H6N6亚型AIV各基因片段的变化,筛选H6N6亚型AIV在猪复制的基因特点。结果:病毒体外接种猪呼吸道组织后病毒分离阳性,肺局部细胞出现坏死,肺泡细胞内病毒核蛋白(NP)抗原阳性,其中A/CK/ZZ/346/2014(ZZ346)病毒株复制能力较强。基因测序和分析显示,H6N6亚型AIV的血凝素(HA)裂解位点模式属低致病性病毒,ZZ346病毒株HA出现P186T突变、HA的158位点有氨基酸缺失以及神经氨酸酶(NA)颈区出现11个氨基酸(59~69)缺失。结论:鸡源性H6N6亚型AIV可感染猪;H6N6病毒HA出现P186T突变、HA158位点出现氨基酸缺失以及NA颈区出现11个氨基酸(59~69)缺失有助于病毒在猪体内有效复制。

鸭源性H6N6禽流感病毒对小鼠致病性研究

目的:探讨鸭源H6N6亚型禽流感病毒(AIV)是否能跨种间屏障感染哺乳动物小鼠及其基因特点。方法:首先将前期分离的3株鸭源性AIVH6N6,应用基因测序和分析法,比较病毒各基因片段的变化,然后将病毒接种BALB/c小鼠,观察病毒在小鼠复制、感染、病理变化及其组织亲嗜性。结果:基因测序和分析显示,鸭源H6N6亚型AIV的血凝素(HA)裂解位点模式属低致病性病毒,其HA、神经氨酸酶(NA)、PB2等关键基因位点未出现突变,病毒与禽型受体SAα-2,3Gal特异性结合。病毒接种小鼠后,小鼠鼻甲、气管、肺组织出现炎症反应和病毒分离阳性。免疫组化检测病毒NP蛋白显示小鼠鼻甲、气管和支气管黏膜上皮细胞以及肺泡细胞阳性,其中A/DK/KM/1135/2019病毒株复制、感染能力较强。结论:鸭源性AIVH6N6可跨种间屏障传播给哺乳动物,提示有必要持续、密切监测水禽H6N6病毒的进化演变,以防其传播给人。

番鸭源H6N6亚型禽流感病毒全基因组的分子特征

【目的】为了丰富水禽源禽流感病毒的分子流行病学资料,明确我国国内首次分离的番鸭源H6N6亚型禽流感（Avian influenza virus,AIV）病毒A/Muscovy Duck/Fujian/FZ01/2008（H6N6）（以下简称MD/FJ/F1/08）全基因组的分子特征,弄清该病毒的遗传进化特点。【方法】对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,并利用分子生物学软件对测序结果进行序列分析。【结果】MD/FJ/F1/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为PSMKVIV↓GL,为非连续的碱性氨基酸,其静脉接种指数（the intravenoys pathogenicity index,IVPI）为0.15,推测其为一株低致病力AIV。其HA基因、NP基因、M基因和PB2基因均与我国台湾分离株A/duck/Kingmen/E322/04（H6N2）该基因的核苷酸同源性最高,分别高达94.2%、95.7%、97.2%和95.6%,均处于同一遗传进化分支。其NA基因和我国远东分离株A/duck/Eastern China/01/2007（H4N6）同源性最高,达97.1%;其颈部有11个氨基酸的缺失（TNSTTTIINNN）,为N6亚型神经氨酸酶基因中首次报道,在遗传进化上和H4N6亚型AIV的NA基因处于相同的分支。NS基因和香港地区分离株A/duck/HongKong/3600/99（H6N2）同源性最高,达96.1%;PB1和PA均与高致病性禽流感病毒株A/duck/HongKong/140/1998（H5N1）同源性最高,达95.6%和96.7%。且MD/FJ/F1/08的8基因与H6N6亚型流感病毒北美洲分离代表株均不处在同一遗传进化分支上,相互之间遗传关系较远。【结论】MD/FJ/F1/08可能是由H6N2、H4N6和H5N1等多亚型AIV基因重组而成。