基于血凝素蛋白特异性抗体的H7亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法建立

目的基于H7亚型流感病毒,制备针对于HA抗原的单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA检测体系,为其在流感病毒快速检测试剂研发中提供技术储备。方法用H7亚型禽流感病毒HA重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤技术制备HA特异性单克隆抗体,筛选可在双抗体夹心ELISA技术平台上使用的配对抗体,初步探索该ELISA体系的检测特异性、敏感性和广谱性。结果共制备出6株HA特异性单克隆抗体,并成功筛选出捕获抗体8B11-C9及检测抗体7C3-G5的最佳配对。该双抗体夹心体系对HA重组蛋白的检测灵敏度可达到1.56 ng/mL,能有效检测出不同宿主来源的H7亚型流感病毒,与其他亚型流感病毒无交叉。结论成功制备出H7亚型流感病毒HA单克隆抗体,建立了H7亚型流感病毒特异性的双抗体夹心ELISA检测方法,为其快速检测试剂研发奠定了基础。

陕西省榆林市某县规模鸡场H7亚型流感血清学调查与风险因素分析

为了解H7亚型流感在规模鸡场的血清学流行率、分布情况和风险因素,2017年4—5月,以陕西省榆林市某县存栏大于500羽的267个规模鸡场为研究对象,采取两阶段抽样方法,对该县144个规模场开展了血清学检测和问卷调查。结果显示:该县规模鸡场H7亚型流感表观流行率(HPA)为13.89%(95%CI:8.69%～20.63%);阳性区域相对集中,20个血清学阳性场中,有11个分布在2个镇。单因素分析显示:"本场人员到过其他禽场""有外来车辆进入本场"2个因素具有统计学意义。针对上述2个风险因素,建立的多因素回归分析模型的拟合度较好,ROC曲线下面积为0.714(95%CI:0.585～0.843)。结果提示,规模鸡场要严格控制场间的人员流动,外来车辆进入本场时要做好消毒。

几种H7亚型流感病毒荧光RT-PCR试剂盒的比对试验

试验对几种商品化H7亚型流感病毒荧光RT-PCR试剂盒进行了比对,试验表明,CT值与模板浓度具有良好的线性关系,3个厂家敏感性差异较大,为H7亚型流感的早期快速诊断提供了指导。

2022年湖南省家禽H7N9亚型禽流感监测与分析

为了解湖南省家禽(鸡、鸭、鹅)H7N9亚型禽流感的免疫抗体水平及其流行情况,2022年在全省14个市州,采用配额抽样方法,在种禽场、商品代场、散养户和活禽市场共采集46112份禽血清和53246份禽拭子样品,通过血凝抑制试验、荧光定量PCR方法分别进行免疫抗体和病毒核酸检测。结果显示:H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率为93.27%,平均个体合格率为90.60%,仅在活禽市场的1份鸡拭子样品中检测到病毒核酸阳性;鸡H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率和个体合格率(94.66%和91.51%)均高于水禽(83.26%和81.86%);种禽场的免疫抗体平均场群合格率和个体合格率最高,活禽市场最低,两者差异具有统计学意义(P<0.05);全省14个市州的H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率和个体合格率均在70%以上。结果表明:2022年湖南省家禽H7N9亚型禽流感免疫效果较好,在饲养场禽群中也未检出病原,发生大规模疫情的风险较低,但在活禽市场中仍检出病原,且水禽以及散养户和活禽市场禽群的免疫抗体水平略低,疫情散发风险依然存在。建议进一步加强对H7N9亚型禽流感的免疫监测以及动物检疫监管工作,不断提升公共卫生安全防护水平。

H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。

新型水禽用三价禽流感病毒载体疫苗可有效阻断H5和H7亚型禽流感病毒感染与传播

2020年以来,H5亚型高致病性禽流感病毒先后在欧洲出现,并在欧洲引发大规模疫情,随后通过野鸟迁徙传入非洲、亚洲及北美多个国家,引起更大规模的疫情暴发。据世界动物卫生组织(WOAH)统计,新型H5N8和H5N1病毒在全球已累计导致约3亿多只家禽死亡或被扑杀,给养禽业造成了巨大损失。此次禽流感疫情导致大量家禽死亡或被扑杀,部分国家出现了“鸡蛋荒”。

稳定表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的293T细胞株构建及应用

为获得用于评价H7N9亚型禽流感疫苗诱导的抗体Fc免疫效应的靶细胞,研究采用慢病毒包装与感染技术构建一株稳定表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)HA蛋白的细胞株,并以该细胞株为靶细胞建立H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清补体介导的细胞毒(ADCML)活性的检测方法。结果显示成功包装了一株重组慢病毒,滴度可达108 FU/mL;构建了稳定表达H7N9 AIV HA蛋白的293T细胞株,HA蛋白主要在细胞膜上表达。基于新城疫病毒(NDV)载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫鸡后,诱导产生的HA结合性IgG抗体滴度为2180。以稳定细胞株为靶细胞,载体疫苗血清诱导的细胞死亡水平显著高于空载体与未免疫鸡血清(P<0.001);补体灭活后,载体疫苗血清诱导的细胞死亡水平显著降低(P<0.001)。研究表明,基于NDV载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫鸡血清具有较强的ADCML活性,稳定表达H7N9 AIV HA蛋白的细胞株可作为评价H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清Fc免疫效应的靶细胞。

2019~2021年花溪区H5、H7亚型禽流感免疫抗体监测情况及分析

为了解2019~2021年花溪区的禽流感免疫效果,对其管辖的部分涉农乡镇(街道)随机采集120~400日龄的鸡群血清样品4 391份,采用血凝抑制试验对禽流感H5和H7亚型进行免疫抗体检测,根据高致病性禽流感诊断技术中抗体效价标准进行判定,HI抗体效价≥4log2,判定个体免疫效力合格;群体免疫抗体合格率≥70%,判为群体抗体合格率达标。检测结果显示,花溪区(H5+H7亚型)禽流感免疫抗体合格率2019、2020、2021年依次为91.03%、91.78%、96.19%,呈现逐年上升趋势;H7亚型抗体合格率高于H5亚型,规模化鸡场抗体合格率高于大户和散养户。综上所述,禽流感免疫抗体合格率均高出国家标准,说明全区免疫工作较扎实有效;监测禽流感免疫抗体为花溪区科学预防H5、H7亚型禽流感的流行提供数据支撑,推动花溪区的家禽业健康持续发展。

不同因素对禽流感病毒H7亚型血凝——血凝抑制试验的影响

本文分别从抗体稀释液、红细胞悬液、孵育温度、抗体作用时间等不同因素分析禽流感病毒H7亚型血凝血凝实验效果的影响,在操作、方法、人为等因素进行规范,从而避免血凝抑制试验的失败和实验准确性,进而提高免疫抗体的监测准确性、可靠性、稳定性,为一线疫病监测特别是流感检测提供可鉴之资。

H7N9亚型亚型流感流行病学特征及防控建议

H7N9亚型流感给我国家禽养殖业造成了较大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。H7N9亚型流感病毒已出现高致病性变异株并引起我国家禽发生数起疫情,防控形势十分严峻。文章从H7N9亚型流感病原学和流行病学特征角度,总结了目前我国H7N9亚型流感防控的重点和难点,阐述H7N9亚型流感防控策略,提出相关防控建议,旨在科学引导公众正确认识H7N9亚型流感,普及基本防控知识,推进防控措施的落实,为最终有效防控和根除该病提供有益参考。

养殖场生物安全体系建设在防控家禽H7N9亚型流感中的作用

养殖场生物安全体系建设不仅关乎养殖的质量和农户的经济收益,还关乎畜禽和人的生命安全,具有重要的公共卫生意义。2017年H7N9亚型高致病性禽流感疫情频发,除跟病毒本身极易发生变异密切相关外,鸡场生物安全体系建设不健全不规范也是疫情频发的重要因素。文章对养殖场生物安全体系建设的必要性和重要性、规范建设举措进行概述,探索生物安全体系建设如何在家禽H7N9亚型流感防控方面发挥作用。

贵州省H7亚型禽流感病毒感染的血清学和病原学分析

为了解贵州省近几年H7亚型禽流感病毒感染情况,分别采集鸡血清3 031份、卵黄962份、咽-肛拭子1 607份、环境土壤拭子394份及野鸟粪便122份样本共计6 116份,采用血凝抑制试验(HI)和实时荧光定量RT-PCR方法进行H7亚型禽流感病毒特异性抗体和核酸检测。结果显示,在鸡血清和卵黄样本中,H7亚型禽流感表达特异性抗体的阳性率分别为1.2%(37/3 031)和2.3%(22/962);在2 123份鸡咽-肛拭子、环境样本和野鸟粪便中,均未检测出H7亚型禽流感病毒核酸。这些结果表明贵州省家禽、野鸟和环境土壤中尚未发现H7亚型禽流感病毒感染。

湖南省东安县家禽高致病性HH7N9亚型流感诊断报告

2017年3月湖南省东安县部分养殖场的蛋鸡出现大量发病和死亡情况,对采集的15份病料进行实验室检测,经国家禽流感参考实验室确诊,疫情为H7N9亚型高致病性流感病毒感染所致。这是我国首次发现H7N9亚型流感病毒引起家禽发病死亡。调查显示,此次疫情由鸡笼、车辆等器具将H7N9亚型流感病毒从市场传入养殖场的可能性较大。建议通过提高养殖场的生物安全措施、加强活禽市场的管理、强化H7N9亚型流感病毒监测与流通监管等措施来防控H7N9亚型流感。

不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白的比较分析

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。

H7亚型禽流感病毒对家禽和人感染回顾及H7N9亚型流感防控建议

截止于2013年4月2日，国家卫生和计划生育委员会通报我国上海市、安徽省和江苏省共发现7例人感染H7N9禽流感病例，其中2例死亡。由于H7N9禽流感病毒感染人是世界范围首次出现的事件，该消息一经报出，立即引发了很大的反响，人们担忧此次出现的新型流感病毒是否会形成大流行。鉴于当前对该病毒的基因特性、生物学特性及传播能力尚不清晰，为了使读者更好的认识H7N9亚型禽流感病毒，本文回顾H7亚型流感病毒的特性、H7亚型禽流感病毒在家禽中的流行情况和对人类的感染情况，

H7和N9亚型及A型流感病毒多重荧光定量RT-RCR检测方法的建立

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性。同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/m L。批内和批间试验的变异系数均小于1.48%。利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份。该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定。

H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测H7N9亚型流感病毒的通用荧光RT-PCR方法,根据GenBank数据库中收录的相关基因组序列,应用Primer 5.0软件设计合成针对H7和N9序列的特异性引物和Taq Man探针,并对该方法开展特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:H7和N9核酸片段最低检测限均为1.7×10^(3) copies/mL;使用该方法重复检测10次,H7和N9核酸片段检测的变异系数(CV)<1%,说明稳定性良好;利用第二代人感染H7N9流感病毒核酸检测试剂国家参考品样品,测得该方法灵敏度为100%(10/10)、特异度为100%(20/20)。结果表明,本研究建立的H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR方法快速、准确、稳定性高、特异性好,为控制流感病毒传播增添了技术手段。

政府干预HH7N9亚型流感疫情的演化博弈研究

政府与社会民众的策略互动是人感染H7N9亚型流感防控工作的核心内容。文章研究了H7N9亚型流感疫情暴发初期阶段政府部门与社会民众关于疫情防控的互动关系,得出了政府部门与社会民众之间的博弈均衡策略。利用博弈均衡策略对传染病SI扩散模型进行丰富,建立H7N9亚型流感疫情传播扩散方程,并依据官方公布的2013年我国内地H7N9亚型流感疫情每日新增确诊病例数进行Logistic参数估计。研究发现,H7N9亚型流感疫情的防控工作应当把握"主动性"和"科学性"的原则。科学主动对待新型疫情是政府博弈均衡的最优策略,而随疫情状况与社会认识的发展,科学调整防控措施则是防控疫病制胜的关键。

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因。双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础。

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。