H7N7亚型马流感病毒单克隆抗体的制备

目的制备抗H7N7亚型马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的单克隆抗体,以建立特异、灵敏、简便的H7N7亚型流感病毒金标试纸检测方法。方法以H7N7亚型EIV为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过血凝抑制(HI)试验和间接ELISA筛选能稳定分泌抗H7N7亚型EIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其分泌的单抗进行生物学特性鉴定。结果筛选出3株能稳定分泌抗H7N7亚型EIV单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5B2、1C10和2B7;5B2和1C10株单抗为IgG2a亚型,2B7单抗为IgG M亚型,轻链均为κ链;3株单抗均只与H7N7亚型EIV发生特异性反应,而不与H3N8亚型EIV、马动脉炎病毒(EAV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马乙型脑炎病毒(JEV)发生交叉反应,特异性良好。结论已制备出3株针对H7N7亚型EIV的单克隆抗体,为H7N7亚型马流感疫情的快速诊断以及流行病学调查提供了良好的材料。

马流感病毒2个亚型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)2个亚型的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将马流感病毒甲1型A/equine/布拉格/56 H7N7(简称H7N7)和马流感病毒甲2型A/equine/miami/63 H3N8(简称H3N8)分别接种SPF鸡胚,收获尿囊液,纯化后免疫BALB/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0细胞进行融合,筛选阳性杂交瘤细胞,采用细胞培养法和体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。结果筛选出能稳定分泌EIV H7N7单抗和H3N8单抗的杂交瘤细胞各2株,分别命名为3C2-B2、2B7-3A7和5G10-G12、5A10-2E3-2G4。3C2-B2分泌的单抗重链为IgM,轻链为κ链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶512和1∶262 144;5G10-G12分泌的单抗重链为IgG2a,轻链为κ链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶1 024和1∶1 048 576。2个亚型的单抗均具有良好的特异性。获得的杂交瘤细胞株连续培养2个月,培养上清中的抗体效价保持不变;冻存1个月复苏后,培养上清中的抗体效价接近原始值。结论成功制备了EIV 2个亚型的单克隆抗体,为进一步研制EIV快速分型特异性诊断试剂及治疗制剂奠定了基础。

可视化等温扩增法快速筛查并分型禽流感病毒

目的:建立一种通用筛查禽流感病毒及其3种亚型的快速核酸检测方法。方法:对20例已知样本扩增禽流感病毒共有的M基因上的一段保守序列快速筛查并确定是否为禽流感病毒,扩增禽流感病毒(H5N1,H7N7,H9N2)3种亚型特异性HA基因上一段序列鉴定禽流感病毒的基因型。采用环介导等温扩增法检测核酸,用肉眼观察双链嵌合染料SYBR Green I荧光显色信号强度。结果:3种禽流感病毒亚型的检测灵敏度均为10拷贝/管,3组引物间无非特异性扩增。18例阴性,2例阳性,准确性及特异性均为100%。结论:建立的核酸检测方法适合现场快速检测禽流感病毒及其3种亚型。

马流感病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

为研制马流感快速分型特异性诊断试剂，我们以马流感纯化病毒（EIV）的两个型病毒分别免疫BALA／c小鼠，采用细胞杂交瘤技术筛选克隆出分别针对两型EIV的单克隆抗体细胞株4株，其中经检测分别命名为3C2-B2-F10甲1单抗细胞株、5G10-G12-A10甲2单抗细胞株，抗体亚类检测试剂盒鉴定3C2-B2-F10为IgM、轻链为K链抗体，5G10-G12-A10IgG2a、K链抗体，均具有稳定分泌高效价单抗能力，针对EIVA／equine／布拉格／56H7N7的间接ELISA抗体效价达到291：512（上清液）与2^181：262144（腹水）；针对EIVA／equine／miami／63H3N8的间接ELISA抗体效价达到2^101：1024（上清液）与2^201：1048576（腹水）。特异性高，以Western Blot分析A／equine／布拉格／56H7N7马流感病毒（EIV）、A／equine／miami／63H3N8马流感病毒（EIV）、马动脉炎病毒（EAV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、马乙型脑炎病毒（JEV）为抗原，病毒样品不发生交叉反应，其金标夹心检测病毒效果良好。