2022年湖南省家禽H7N9亚型禽流感监测与分析

为了解湖南省家禽(鸡、鸭、鹅)H7N9亚型禽流感的免疫抗体水平及其流行情况,2022年在全省14个市州,采用配额抽样方法,在种禽场、商品代场、散养户和活禽市场共采集46112份禽血清和53246份禽拭子样品,通过血凝抑制试验、荧光定量PCR方法分别进行免疫抗体和病毒核酸检测。结果显示:H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率为93.27%,平均个体合格率为90.60%,仅在活禽市场的1份鸡拭子样品中检测到病毒核酸阳性;鸡H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率和个体合格率(94.66%和91.51%)均高于水禽(83.26%和81.86%);种禽场的免疫抗体平均场群合格率和个体合格率最高,活禽市场最低,两者差异具有统计学意义(P<0.05);全省14个市州的H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率和个体合格率均在70%以上。结果表明:2022年湖南省家禽H7N9亚型禽流感免疫效果较好,在饲养场禽群中也未检出病原,发生大规模疫情的风险较低,但在活禽市场中仍检出病原,且水禽以及散养户和活禽市场禽群的免疫抗体水平略低,疫情散发风险依然存在。建议进一步加强对H7N9亚型禽流感的免疫监测以及动物检疫监管工作,不断提升公共卫生安全防护水平。

稳定表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的293T细胞株构建及应用

为获得用于评价H7N9亚型禽流感疫苗诱导的抗体Fc免疫效应的靶细胞,研究采用慢病毒包装与感染技术构建一株稳定表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)HA蛋白的细胞株,并以该细胞株为靶细胞建立H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清补体介导的细胞毒(ADCML)活性的检测方法。结果显示成功包装了一株重组慢病毒,滴度可达108 FU/mL;构建了稳定表达H7N9 AIV HA蛋白的293T细胞株,HA蛋白主要在细胞膜上表达。基于新城疫病毒(NDV)载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫鸡后,诱导产生的HA结合性IgG抗体滴度为2180。以稳定细胞株为靶细胞,载体疫苗血清诱导的细胞死亡水平显著高于空载体与未免疫鸡血清(P<0.001);补体灭活后,载体疫苗血清诱导的细胞死亡水平显著降低(P<0.001)。研究表明,基于NDV载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫鸡血清具有较强的ADCML活性,稳定表达H7N9 AIV HA蛋白的细胞株可作为评价H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清Fc免疫效应的靶细胞。

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为106.5 EID50·m L-1的H7N9亚型禽流感病毒尿囊液依次进行10倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测H1—H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1—N9亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9亚型AIV样品有特异性目的条带,与其他N1—N9亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为1.4×102.5 EID50·m L-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。

H7N9亚型亚型流感流行病学特征及防控建议

H7N9亚型流感给我国家禽养殖业造成了较大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。H7N9亚型流感病毒已出现高致病性变异株并引起我国家禽发生数起疫情,防控形势十分严峻。文章从H7N9亚型流感病原学和流行病学特征角度,总结了目前我国H7N9亚型流感防控的重点和难点,阐述H7N9亚型流感防控策略,提出相关防控建议,旨在科学引导公众正确认识H7N9亚型流感,普及基本防控知识,推进防控措施的落实,为最终有效防控和根除该病提供有益参考。

养殖场生物安全体系建设在防控家禽H7N9亚型流感中的作用

养殖场生物安全体系建设不仅关乎养殖的质量和农户的经济收益,还关乎畜禽和人的生命安全,具有重要的公共卫生意义。2017年H7N9亚型高致病性禽流感疫情频发,除跟病毒本身极易发生变异密切相关外,鸡场生物安全体系建设不健全不规范也是疫情频发的重要因素。文章对养殖场生物安全体系建设的必要性和重要性、规范建设举措进行概述,探索生物安全体系建设如何在家禽H7N9亚型流感防控方面发挥作用。

鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组学分析

目的为了分析鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡后宿主基因表达水平的变化。方法以鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡,收集肺脏进行高通量测序。结果与对照组相比,感染组得到差异表达基因740个,其中上调基因有602个,下调基因有138个。GO条目分析发现,差异基因主要涉及免疫应答反应和炎症反应等。经KEGG数据库比对注释及富集分析显示有7个通路富集显著,其中Toll-like信号通路有11个基因表达上调,分别为IL-6、TLR4、PIK3、IRF7、MD-2、IRF5、MYD88、CD86、STAT1、TLR2和CCL4,NOD-like受体信号通路有7个基因表达上调,分别为IRF7、CTSB、P2RX7、CYBB、PSTPIP1、HSP90AA1和NAMPT。结论鸭源H7N9亚型病毒感染SPF鸡后,免疫相关基因表达明显增强。在Toll-like信号通路中,TLR4在MD-2的协助下被激活,随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5,继而引起CCL4、IL-6显著表达。同时NLRP3炎症体在H7N9亚型病毒感染过程中也发挥着重要作用。

湖南省东安县家禽高致病性HH7N9亚型流感诊断报告

2017年3月湖南省东安县部分养殖场的蛋鸡出现大量发病和死亡情况,对采集的15份病料进行实验室检测,经国家禽流感参考实验室确诊,疫情为H7N9亚型高致病性流感病毒感染所致。这是我国首次发现H7N9亚型流感病毒引起家禽发病死亡。调查显示,此次疫情由鸡笼、车辆等器具将H7N9亚型流感病毒从市场传入养殖场的可能性较大。建议通过提高养殖场的生物安全措施、加强活禽市场的管理、强化H7N9亚型流感病毒监测与流通监管等措施来防控H7N9亚型流感。

不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白的比较分析

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。

H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测H7N9亚型流感病毒的通用荧光RT-PCR方法,根据GenBank数据库中收录的相关基因组序列,应用Primer 5.0软件设计合成针对H7和N9序列的特异性引物和Taq Man探针,并对该方法开展特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:H7和N9核酸片段最低检测限均为1.7×10^(3) copies/mL;使用该方法重复检测10次,H7和N9核酸片段检测的变异系数(CV)<1%,说明稳定性良好;利用第二代人感染H7N9流感病毒核酸检测试剂国家参考品样品,测得该方法灵敏度为100%(10/10)、特异度为100%(20/20)。结果表明,本研究建立的H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR方法快速、准确、稳定性高、特异性好,为控制流感病毒传播增添了技术手段。

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因。双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础。

政府干预HH7N9亚型流感疫情的演化博弈研究

政府与社会民众的策略互动是人感染H7N9亚型流感防控工作的核心内容。文章研究了H7N9亚型流感疫情暴发初期阶段政府部门与社会民众关于疫情防控的互动关系,得出了政府部门与社会民众之间的博弈均衡策略。利用博弈均衡策略对传染病SI扩散模型进行丰富,建立H7N9亚型流感疫情传播扩散方程,并依据官方公布的2013年我国内地H7N9亚型流感疫情每日新增确诊病例数进行Logistic参数估计。研究发现,H7N9亚型流感疫情的防控工作应当把握"主动性"和"科学性"的原则。科学主动对待新型疫情是政府博弈均衡的最优策略,而随疫情状况与社会认识的发展,科学调整防控措施则是防控疫病制胜的关键。

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。

H7N9亚型禽流感对辽宁省畜牧业的影响及其对策

禽流感已成为国际上广泛关注的公共卫生事件,因此,加强对流感状况的认识和了解将有助于人们有效地防控流感。本文对禽流感病毒的流行现状及对辽宁省畜牧业的影响进行综述,旨在为有效防制禽流感提供理论依据。

表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组杆状病毒疫苗候选株的构建与免疫效果评估

为了有效防控H7N9亚型禽流感疫情,研制能够预防高致病性H7N9亚型禽流感的疫苗非常必要。研究基于昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS),构建并拯救了一株表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)的重组杆状病毒rBac-GD15HA。间接免疫荧光试验及免疫印迹试验鉴定结果表明rBac-GD15HA的HA蛋白在Sf9细胞中成功表达;重组病毒细胞传代试验结果表明rBac-GD15HA在传代过程中能保持较高的病毒滴度,且遗传稳定;鸡的免疫试验结果显示,重组疫苗在一次免疫后即能诱导较高水平的针对H7N9 AIV的抗体应答,并能提供针对高致病性H7N9 AIV 100%的临床保护。因此,研究结果可作为H7N9亚型禽流感疫苗研发策略的参考,为其防控提供一种安全有效的方法,也为今后广谱流感疫苗的研发奠定一定的基础。

H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株灭活疫苗的研制

利用H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株进行灭活疫苗的研制,并对疫苗的免疫效果进行评价,为家禽H7N9亚型流感的防控提供科学数据及手段。将AIV-rGD76株用灭菌生理盐水作104倍稀释后,接种11日龄非免疫鸡胚,37℃孵育72h后收获感染鸡胚尿囊液,经甲醛灭活后,加矿物油佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗,对制备疫苗的性状、安全性、免疫效力等进行检验。结果显示,制备的3批重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株)均为油包水型,黏度均在50cP以内,对3批疫苗取样,样品经3000r/min离心15min,管底无水相析出。安全性试验结果显示,将疫苗按1mL/只超剂量接种3周龄SPF鸡,试验鸡在观察期内全部健活,未出现局部或全身不良反应,表明疫苗对SPF鸡具有良好的安全性;免疫效力及攻毒保护试验结果显示,用疫苗按0.3mL/只的剂量免疫接种3周龄SPF鸡1次,免疫接种后21d试验鸡血清中rGD76株的HI抗体平均效价可达8log2以上,使用H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD16株滴鼻接种0.2mL/只(含100LD50)对免疫鸡进行攻毒,疫苗对免疫鸡的保护率均为100%。在实验室条件下研制出重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株),疫苗的各项指标均符合标准。

H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在杆状病毒中的表达及其免疫效力评估

旨在利用杆状病毒表达系统构建1株对高致病性H7N9亚型禽流感病毒(A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016)攻击后的家禽提供保护的候选疫苗株。用同源重组的方法构建1株表达H7N9亚型禽流感病毒(A/chicken/Shaoxing/5201/2013株)血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的重组杆状病毒。用PCR技术鉴定重组杆状病毒rBac-SX5201HA的遗传稳定性,用间接免疫荧光方法和Western Blotting方法鉴定HA蛋白的表达情况,用血凝试验检测HA蛋白的体外活性,继而对重组疫苗在无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)鸡上进行免疫效力试验,并对免疫后21 d的SPF鸡血清进行抗体检测,对攻毒5 d后的鸡咽喉和泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,重组杆状病毒rBac-SX5201HA在昆虫细胞中生长良好,且可稳定高效表达H7 HA蛋白,血凝效价可达2^(6);重组疫苗免疫SPF鸡21 d后可诱导2^(8.4)血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)抗体效价并能抵抗高致病性H7N9亚型禽流感病毒的攻击,免疫组SPF鸡群均未发病或死亡,仅有17%的SPF鸡在攻毒后第5 d出现排毒。可以看出,重组疫苗对高致病性H7N9亚型禽流感病毒攻击后的SPF鸡提供了100%的保护,且可有效抑制病毒在SPF鸡体内的复制。

低致病性与高致病性H7N9亚型禽流感病毒分子特征及受体结合能力分析

对2017年从鸡病料中分离到的2株H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)A/chicken/Hubei/093/2017(H7N9)和A/chicken/Hubei/207/2017(H7N9)(CK93和CK207)进行了全基因组测序。对血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)序列保守性、HA糖基化位点、NA耐药位点和6个内部基因的关键氨基酸位点进行了分析,同时测定了2株毒株的受体结合能力。结果显示,CK93毒株HA裂解位点为PEIPKGR↓GLF,为低致病性AIV特征;而CK207毒株裂解位点为PKP⁃KRTAR↓GLF,为高致病性AIV特征。HA第226位氨基酸在CK93毒株为亮氨酸(226L),而在CK207毒株为谷氨酰胺(226Q)。但受体结合能力测定发现,CK93和CK207都具有结合α-2,3唾液酸受体和α-2,6唾液酸受体的特性,说明Q226L并非影响病毒受体结合特性的决定性因素。本研究结果提示应加强对H7N9亚型禽流感病毒变异监测预防其突变可能造成流行的风险。

不同年代的低致病性HH7N9亚型禽流感病毒对SPF鸡致病性的研究

为了了解前4个流行波次中低致病性H7N9亚型禽流感病毒致病性的特点,选择2013~2016年不同年代的H7N9代表株进行了SPF鸡致病性试验,系统比较了各病毒在排毒、复制、诱导宿主免疫应答及引起鸡肺脏病理变化等方面的差异。致病性结果表明所有的鸡都没有明显的临床症状也未死亡。肺损伤及排毒结果显示,2016年分离的TZHY22引起的肺损伤最严重且其排毒能力最强、排毒持续时间长。病毒复制能力结果显示,2013年分离的TM24复制能力最强,能在多个脏器中(心、肝、脾、肺、肾、脑)高效复制。然而,2014年分离的JX148虽然复制能力和排毒能力都很弱,但其引起的细胞因子免疫应答最强烈,并对宿主脏器造成了一定的病理损伤。以上结果表明,不同年代的病毒在排毒、复制及致病力等方面各不相同,其强弱并没有随着年代的推移呈现规律性变化。研究为H7N9亚型禽流感病毒的致病机理研究和疫苗评价奠定了一定的基础。

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的：对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1（NS1）基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法：从GenBank获得2006-2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果：经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%-100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%-90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论：为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。

H7N9亚型流感病毒受体结合特性的研究进展

自2013年以来,H7N9亚型禽流感病毒跨越种属屏障在人群中已引起了至少5波流行高峰。尽管目前的研究表明该型病毒尚不能在人际间高效传播,但如果病毒结合α-2,6唾液酸受体的能力获得进一步增强,其引发流感大流行的潜在威胁将可能更加严重。因此,本文从H7N9流感病毒表面主要纤突糖蛋白血凝素(HA)的结构、宿主唾液酸受体的分布、病毒受体结合特性的影响因素与检测方法等方面,对H7N9亚型流感病毒受体结合特性的研究进展进行简要综述,以期为人感染禽流感病毒的疫情预警及综合防控提供理论支持。