养殖场生物安全体系建设在防控家禽H7N9亚型流感中的作用

养殖场生物安全体系建设不仅关乎养殖的质量和农户的经济收益,还关乎畜禽和人的生命安全,具有重要的公共卫生意义。2017年H7N9亚型高致病性禽流感疫情频发,除跟病毒本身极易发生变异密切相关外,鸡场生物安全体系建设不健全不规范也是疫情频发的重要因素。文章对养殖场生物安全体系建设的必要性和重要性、规范建设举措进行概述,探索生物安全体系建设如何在家禽H7N9亚型流感防控方面发挥作用。

湖南省东安县家禽高致病性HH7N9亚型流感诊断报告

2017年3月湖南省东安县部分养殖场的蛋鸡出现大量发病和死亡情况,对采集的15份病料进行实验室检测,经国家禽流感参考实验室确诊,疫情为H7N9亚型高致病性流感病毒感染所致。这是我国首次发现H7N9亚型流感病毒引起家禽发病死亡。调查显示,此次疫情由鸡笼、车辆等器具将H7N9亚型流感病毒从市场传入养殖场的可能性较大。建议通过提高养殖场的生物安全措施、加强活禽市场的管理、强化H7N9亚型流感病毒监测与流通监管等措施来防控H7N9亚型流感。

不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白的比较分析

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。

H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测H7N9亚型流感病毒的通用荧光RT-PCR方法,根据GenBank数据库中收录的相关基因组序列,应用Primer 5.0软件设计合成针对H7和N9序列的特异性引物和Taq Man探针,并对该方法开展特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:H7和N9核酸片段最低检测限均为1.7×10^(3) copies/mL;使用该方法重复检测10次,H7和N9核酸片段检测的变异系数(CV)<1%,说明稳定性良好;利用第二代人感染H7N9流感病毒核酸检测试剂国家参考品样品,测得该方法灵敏度为100%(10/10)、特异度为100%(20/20)。结果表明,本研究建立的H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR方法快速、准确、稳定性高、特异性好,为控制流感病毒传播增添了技术手段。

政府干预HH7N9亚型流感疫情的演化博弈研究

政府与社会民众的策略互动是人感染H7N9亚型流感防控工作的核心内容。文章研究了H7N9亚型流感疫情暴发初期阶段政府部门与社会民众关于疫情防控的互动关系,得出了政府部门与社会民众之间的博弈均衡策略。利用博弈均衡策略对传染病SI扩散模型进行丰富,建立H7N9亚型流感疫情传播扩散方程,并依据官方公布的2013年我国内地H7N9亚型流感疫情每日新增确诊病例数进行Logistic参数估计。研究发现,H7N9亚型流感疫情的防控工作应当把握"主动性"和"科学性"的原则。科学主动对待新型疫情是政府博弈均衡的最优策略,而随疫情状况与社会认识的发展,科学调整防控措施则是防控疫病制胜的关键。

一株禽源高致病性H7N9亚型流感病毒分子特性研究

为了研究一株禽源高致病性H7N9亚型流感病毒,分析其变异进化及部分生物学特性,试验以从H7N9亚型流感病毒阳性病死鸡的肺脏组织中提取的总RNA为模板,利用特异性引物扩增出全基因序列,分析其核苷酸和氨基酸序列,利用同源建模在线服务软件SWISS-MODEL对突变位点附近的氨基酸序列空间结构进行研究。结果表明:PCR扩增出H7N9亚型流感病毒8个基因片段,即HA、NA、PA、PB1、PB2、NP、NS、M,这8个基因片段均与A/Chicken/Heinan/ZZ01/2017(H7N9)的相应片段具有较高的同源性;HA的第135,226位和NA第401,429位氨基酸存在突变;除A135V突变外,L226Q、A401T、K429R突变均能导致受体结合位点或唾液酸结合位点体积的改变。说明根据基因同源性分析结果,黑龙江省的H7N9流感疫情可能是从中国中部地区传播而来;根据受体结合位点的分析结果,L226Q、A401T和K429R突变可能影响病毒与宿主细胞间的相互作用。

谈谈H7N9亚型流感的主要防控措施及建议

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正黏病毒科流感病毒属，是一种呈球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，为A型流感病毒，可分为16个H亚型（HI—H16）和9个N业型（N1-N9），因此，禽流感病毒可分为HxNx共144种亚型，H7N9亚型流感病毒是其中的一种。目前，国内引起家禽发病的主要是HSN1和H9N2亚型。2013年3月31日，中国上海市和安徽省首次发现3例人感染H7N9禽流感确诊病例，此后在全国部分地区陆续出现确诊病例，引起国内外广泛的关注，同时对家禽业带来严重的经济损失。

禽类H7N9亚型流感预防措施

对H7N9亚型禽流感的预防提出了几点建议。

H7N9亚型流感病毒特异性中和抗体的筛选及其表位的鉴定

为了获得H7N9亚型流感病毒的中和抗体以及鉴定新的中和表位,以原核表达的H7N9亚型流感病毒SZ19毒株血凝素蛋白HA1亚基作为免疫原,通过杂交瘤细胞技术,构建筛选得到4株单克隆抗体杂交瘤细胞株2B2B3、3C5D6、4E12D6、9F10G3;将杂交瘤细胞扩大培养后,注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠腹腔,制备获得4株单克隆抗体;对制备的4株单克隆抗体的特异性、ELISA效价、中和活性等生物活性进行鉴定与筛选。结果表明,筛选获得1株能够特异性识别H7N9亚型流感病毒HA蛋白的中和单克隆抗体2B2B3,其半数抑制浓度(IC_(50))为67.8 ng/μL,ELISA效价为4 096,为具有κ轻链的Ig G2b亚类,并通过肽扫描技术鉴定出H7N9亚型流感病毒HA蛋白高度保守的中和表位^(115)ALRQILRESGGIDKEA^(130)。

2022年湖南省家禽H7N9亚型禽流感监测与分析

为了解湖南省家禽(鸡、鸭、鹅)H7N9亚型禽流感的免疫抗体水平及其流行情况,2022年在全省14个市州,采用配额抽样方法,在种禽场、商品代场、散养户和活禽市场共采集46112份禽血清和53246份禽拭子样品,通过血凝抑制试验、荧光定量PCR方法分别进行免疫抗体和病毒核酸检测。结果显示:H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率为93.27%,平均个体合格率为90.60%,仅在活禽市场的1份鸡拭子样品中检测到病毒核酸阳性;鸡H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率和个体合格率(94.66%和91.51%)均高于水禽(83.26%和81.86%);种禽场的免疫抗体平均场群合格率和个体合格率最高,活禽市场最低,两者差异具有统计学意义(P<0.05);全省14个市州的H7N9亚型禽流感免疫抗体平均场群合格率和个体合格率均在70%以上。结果表明:2022年湖南省家禽H7N9亚型禽流感免疫效果较好,在饲养场禽群中也未检出病原,发生大规模疫情的风险较低,但在活禽市场中仍检出病原,且水禽以及散养户和活禽市场禽群的免疫抗体水平略低,疫情散发风险依然存在。建议进一步加强对H7N9亚型禽流感的免疫监测以及动物检疫监管工作,不断提升公共卫生安全防护水平。

稳定表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的293T细胞株构建及应用

为获得用于评价H7N9亚型禽流感疫苗诱导的抗体Fc免疫效应的靶细胞,研究采用慢病毒包装与感染技术构建一株稳定表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)HA蛋白的细胞株,并以该细胞株为靶细胞建立H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清补体介导的细胞毒(ADCML)活性的检测方法。结果显示成功包装了一株重组慢病毒,滴度可达108 FU/mL;构建了稳定表达H7N9 AIV HA蛋白的293T细胞株,HA蛋白主要在细胞膜上表达。基于新城疫病毒(NDV)载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫鸡后,诱导产生的HA结合性IgG抗体滴度为2180。以稳定细胞株为靶细胞,载体疫苗血清诱导的细胞死亡水平显著高于空载体与未免疫鸡血清(P<0.001);补体灭活后,载体疫苗血清诱导的细胞死亡水平显著降低(P<0.001)。研究表明,基于NDV载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫鸡血清具有较强的ADCML活性,稳定表达H7N9 AIV HA蛋白的细胞株可作为评价H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清Fc免疫效应的靶细胞。

H7N9亚型亚型流感流行病学特征及防控建议

H7N9亚型流感给我国家禽养殖业造成了较大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。H7N9亚型流感病毒已出现高致病性变异株并引起我国家禽发生数起疫情,防控形势十分严峻。文章从H7N9亚型流感病原学和流行病学特征角度,总结了目前我国H7N9亚型流感防控的重点和难点,阐述H7N9亚型流感防控策略,提出相关防控建议,旨在科学引导公众正确认识H7N9亚型流感,普及基本防控知识,推进防控措施的落实,为最终有效防控和根除该病提供有益参考。

马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白的制备及其治疗效果评价

目的制备马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白,并评价其对BALB/c小鼠的治疗效果。方法应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统分别构建的表达H7N9亚型流感病毒HA、NA及M1蛋白的病毒样颗粒制备抗原,免疫健康马匹,当抗体效价达1∶10 000以上时,采血,对血清进行粗处理;采用亲和层析的方法获得纯化的马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2。对纯化的免疫球蛋白进行蛋白含量测定和质量检测。用H7N9亚型流感病毒BALB/c小鼠感染模型评价F(ab’)_2的治疗效果。结果免疫马匹血清中产生高滴度的中和抗体,获得的纯化马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2中和抗体效价达1∶5 120,质量检测合格。攻毒4 h后给药0.4和0.2 mg,小鼠存活率均达100%。结论获得了安全、高效的马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白F(ab’)_2,为人禽流感治疗用制剂的研发提供了参考。

H7和N9亚型及A型流感病毒多重荧光定量RT-RCR检测方法的建立

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性。同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/m L。批内和批间试验的变异系数均小于1.48%。利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份。该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定。

VereFlu芯片检测H7N9亚型流感病毒的效果评价

目的:验证Vere Flu芯片检测H7N9亚型流感病毒的特异性和准确性,为应对流感疫情提供新的实验室检测方法。方法:对流感病毒H7N9亚型、H5N1亚型、H1N1亚型的病毒培养物及10份H7N9感染疫区的鸡肛拭子标本,提取样本的RNA,采用Vere Flu芯片法和Realtime RT-PCR两种检测方法。评估Vere Flu芯片的检测效果。结果:对于3种病毒培养物的检测,Vere Flu芯片均检测到不同亚型的特定阳性信号,每种亚型病毒均未出现交叉反应信号,表明Vere Flu芯片具有较好的检测特异性;10份未知标本中有8份检测流感病毒阴性,2份检测流感病毒阳性,编号为106号及503号,其中106号检测到H7及H9亚型的阳性信号,503号仅检测到H9亚型的阳性信号。Realtime RT-PCR对10份未知标本进行H7亚型核酸检测,从两份流感阳性标本中均检测到H7亚型核酸,高通量测序证实106号和503号标本中均存在H7及H9亚型核酸。结论:Vere Flu芯片可用于不同型别流感病毒的检测和分型,包括新爆发的H7N9亚型病毒同样适用,但检测H7N9亚型的灵敏度低于Realtime RT-PCR法。

休市前后H7N9亚型流感病毒调查以及与人感染病例相关性分析

为研究分析休市前后H7N9亚型流感病毒的检出情况和休市对人感染H7N9疫情的影响,同时为制定人感染H7N9亚型流感控制措施提供依据,本研究根据东莞市春节期间关闭全市所有活禽交易市场的方案,制定了休市前后采样方案,通过荧光RT-PCR检测H7N 9亚型流感病毒核酸,发现活禽交易市场休市消毒对杀灭H7N9亚型流感病毒有明显的效果;休市后人感染H7N9病例明显降低,说明人间病例显著降低可能与关闭全市所有活禽交易市场有一定关联。

H7N9亚型流感病毒对4种消毒剂及紫外线的敏感性研究

为了研究H7N9亚型流感病毒对二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘、氢氧化钠等常用消毒剂及紫外线的敏感性,通过模拟现场消毒场景,将不同种类和不同浓度的消毒剂分别与H7N9亚型流感病毒充分作用,评价病毒对消毒剂的敏感性;评价在紫外照射强度90μW/cm2条件下病毒的存活情况。结果显示:H7N9亚型流感病毒在二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘、氢氧化钠有效浓度分别为1:5 000、0.1%、0.1%、1%的条件下可完全被杀灭;在紫外照射强度90μW/cm^2条件下15min可完全被杀灭,表明H7N9亚型流感病毒对4种消毒剂以及紫外线均具有较强的敏感性。本研究还进行活禽市场的现场验证,与实验室的研究结果一致。

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因。双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础。

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。

人感染H7N9禽流感流行特征与防控策略

2013年3月31日中国大陆出现新型禽流感疫情,此次的H7N9禽流感病毒为全球首次发现的新亚型流感病毒,可能由3种流感病毒重组后产生。截至5月31日,我国内地共报告确诊病例131例,死亡39例。而在上海市报告的33例确诊病例中,29例发病于4月6日上海市关闭活禽交易市场前,其余4例发病于关闭后的第一个潜伏期内。33例病例中60岁以上患者占66.7%(22/33);15例死亡病例中,60岁以上患者占80%(12/15);90.91%(30/33)的病例具有可疑的动物或环境暴露史。此次疫情呈散发,虽然出现了2起家庭聚集性病例,但目前还没有明确的人传人的证据。疫情发生后,上海市人民政府适时启动了流感流行应急预案Ⅲ级响应,通过突发公共卫生事件应急响应、关闭全市活禽交易、健康教育、风险沟通等手段,及时有效地控制了疾病的传播。本文分析这次疫情防控工作的得失并提出建议,供今后的防疫工作借鉴参考。