重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞中培养条件的优化

目的:探索重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株的最佳培养条件,为规模化生产提供参数。方法:通过分析病毒培养液的血清浓度、温度、pH、胰酶终浓度和病毒接种量、收获时间来优化病毒在MDCK上的最佳培养条件。结果:重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞上增殖的最佳培养条件为按接种量MOI 10^(-3),于胰酶终浓度为5μg/L、温度35.0℃、pH7.3±0.1的无血清病毒培养液中培养,收获时间为48~60 h,以48 h最佳。

重组禽流感病毒(H5-H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)在种鸽中免疫的试验效果观察

疫苗免疫仍是预防禽流感的有效手段之一,被一些国家和地区采用。为满足H7亚型流感疫情防控急需,国家禽流感参考实验室研制了重组禽流感病毒（H5-H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株H7-Re1株）。

A/African Startling/England-Q/983/79(H7N1)与我国H7N2亚型禽流感病毒分离株的比较

本研究通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增了禽流感病毒A/AfricanStartling/Eng-land-Q/983/79(A.S/E.Q)(H7N1)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA基因,将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定;并将克隆到的8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较分析。结果表明所克窿到的8个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架;HA、NA基因的序列分析表明A.S/E.Q符合低致病力禽流感病毒的特征;与我国H7N2亚型AIV分离株A/chicken/Hebei/1/02的序列比较发现,A/chicken/Hebei/1/02的HA、M、NP、PB1、PA基因与A.S/E.Q同源性最高,说明我国北部分离的AIV起源于A.S/E.Q。

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的：对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1（NS1）基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法：从GenBank获得2006-2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果：经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%-100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%-90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论：为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。

广州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株监测与基因进化分析

目的通过对广州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株基因变异和进化特点进行分析,掌握本地区H7N9病毒病原学特点,为疾病防控提供参考。方法选取2017年广州市人感染H7N9禽流感病毒阳性标本10份,提取核酸扩增HA、NA、M基因进行测序,通过生物信息学软件分析病毒重要蛋白突变情况和遗传进化特点。结果广州地区H7N9禽流感病毒基因同源性差异较大,大部分毒株基因与广东毒株同源性最高,部分毒株基因与河南、内蒙古等地毒株同源性最高。监测到5株病毒为H7N9禽流感病毒高致病性变异株,部分病毒出现了HA蛋白Q226L的突变,提示对人呼吸道上皮细胞SAα-2, 6Gal受体结合能力增加。HA蛋白和NA蛋白上糖基化位点均有一定的增加和缺失突变。HA、NA和M1蛋白上毒力相关位点均突变增强。M2蛋白均呈现耐药突变,同时监测到2株高致病性突变株出现对神经氨酸酶抑制剂的耐药突变。遗传进化结果显示,HA基因和NA基因在华南和华东分支均有分布,M1基因进化特点相对复杂,分别与华南地区H9N2、H7N9病毒,及北方地区的H7N9病毒重组。结论 2017年广州地区发现2株对达菲耐药的人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株。H7N9禽流感病毒在广州地区不断发生进化重组,具有遗传多样性和复杂性,提示高致病性耐药株有向华南以外地区传播的风险。

人 H7N9禽流感病毒与 H1 N1流感病毒感染小鼠病理学损伤的比较

目的比较分析H7N9病毒与H1N1病毒感染小鼠病理学损伤特点,初步探讨两种病毒感染致小鼠急性肺损伤的致病机制。方法 H7N9病毒与H1N1病毒分别感染小鼠,观察不同病毒感染后小鼠生存率,并于不同时间点取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织,伊红-苏木素染色并进行组织病理学分析,免疫组化检测病毒抗原分布及中性粒细胞浸润。综合分析肺组织病理损伤与病毒复制、宿主免疫反应之间的关系。结果 H7N9病毒感染小鼠肺及脾脏损伤较轻,存活率较高。H1N1病毒感染的小鼠肺及脾脏损伤较重,感染后9 d全部死亡;两种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、少量间质细胞和肺泡上皮细胞,病毒复制水平无明显差异。但H1N1病毒感染后肺及脾脏中均有大量中性粒细胞浸润,小鼠机体炎症反应明显强于H7N9病毒感染后小鼠炎症反应。结论 H7N9病毒与H1N1病毒感染后小鼠病理学损伤特点及程度均不同,病毒复制是小鼠肺损伤的诱发因素但并非决定因素,宿主针对病毒感染产生的免疫反应程度与急性肺损伤密切相关。

7.2分支H5N1亚型禽流感病毒反向遗传疫苗候选株的构建

为应对clade7.2 H5N1亚型禽流感病毒(AIV)持续发生的抗原性改变及其引发的潜在AIV的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果挑选合适的供体株制备疫苗候选株。本研究采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5N1 AIV A/Chicken/Liao Ning/S4092/2011(CK/LN/S4092)基因组为模板经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个连续碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PQIEGRRRKR-突变为-PQRETR-),从而构建出clade7.2 H5N1亚型AIV疫苗候选株rPR8-LN/S4092,为动物免疫试验奠定了基础。

新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析，为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条，运用MEGA5．2．1软件进行序列分析，用邻接法构建基因进化树；通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化；应用Excel表格对氨基酸构成进行计算；运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别，系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成，系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株，并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后，这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。

H1N1流感与H7N9禽流感感染BALB/c小鼠发病特点初步研究

目的本实验旨在初步探讨A/Shanghai/4664T(H7N9)和A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒感染BALB/c小鼠的发病特点,为H7N9致病机制与防治的研究提供数据支持。方法将同等剂量(5×103TCID50)流感病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,分析其在感染后体重、肺指数、病毒载量和肺组织病理的变化情况。结果 H1N1PR8感染组和H7N9感染组小鼠在7 d内体重均持续减低,H1N1 PR8组较H7N9组降低更为明显;在感染后3 d H7N9组与PBS组肺指数无显著差异(P>0.05),但感染后7d H7N9组与PBS组相比显著增高(P<0.05);H1N1PR8组比H7N9组感染后3 d肺指数显著增高(P<0.05),但感染后第7天无显著差异(P>0.05)。H1N1 PR8组和H7N9组病毒载量在感染后第3天均显著升高,但两组无显著差异;第7天两组病毒载量均有所降低,但H7N9组病毒载量显著高于H1N1 PR8组(P<0.05)。H1N1 PR8在感染后3 d主要病理变化为炎症细胞浸润和水肿,而H7N9组主要轻度炎症细胞浸润;在感染后7 dH1N1 PR8组可见大量炎症细胞浸润,出现大面积肺水肿;H7N9组表现为大量炎症细胞浸润。结论 H7N9和H1N1 PR8感染BALB/c小鼠均可发病,但发病特点有所差异,H7N9病毒对鼠的适应性比H1N1 PR8差。

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因。双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础。

人感染H7N9禽流感与甲型H1N1流感重症肺炎的临床及CT影像学特点分析

目的通过对人感染H7N9禽流感与甲型H1N1流感重症肺炎的临床及CT影像学特点的分析及探讨，为以后的临床工作，提供一定价值的参考。方法选择获得临床确诊的人感染H7N9禽流感患者15例和甲型H1N1流感重症肺炎患者25例作为研究对象，对患者的临床表现、并发症以及治疗转归情况进行回顾性分析，对2组患者进行CT影像学检查，并对检查结果展开对比分析。结果经对比发现，H7N9患者气促、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征发生率，入住ICU患者所占比例均显著高于H1N1患者（P＜0.05）；H7N9组患者有创机械通气治疗率、死亡率显著高于H1N1组患者（P＜0.05），好转率显著低于H1N1组（P＜0.05）；H7N9患者CT检查发现小叶间隔变厚、胸腔积液、网格状密度影表现高于H1N1患者（P＜0.05）。结论人感染H7N9禽流感患者的基础疾病较H1N1患者多，并且病情发展迅速，死亡率高，经CT检查可以对H7N9和H1N1患者的影像特征进行客观反映，对于临床治疗具有重要的指导意义。

鸽H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及致病性试验

H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流感病毒时有报道,这其中包括H5N1、H7N9以及H9N2亚型禽流感病毒。虽然H9N2亚型禽流感毒株的致病性相对于H5和H7亚型较低,但是该亚型病毒在我国家禽中存在较为普遍,且目前从鸽子已分离到重组的H9N2毒株,该毒株不仅引起鸽子感染而且具有优先与人类呼吸道表面受体结合的能力,因此加强流感病毒在鸽群中流行情况具有重要的现实意义。

A型禽流感病毒H7N9株NS1基因的克隆和真核表达

目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。

人感染H7N9确诊病例与甲型H1N1重症肺炎的治疗新技术研究

目的 总结我市2014年1至12月共收治11例人感染H7N9确诊病例与36例甲型H1N1重症肺炎流感的治疗心得与技术应用体会,提出运用基因检测和精准医疗技术的运用.方法 对比分析11例人感染H7N9确诊病例与36例甲型H1N1重症肺炎流感的临床指证、并发症、综合评分、实验室数值、治疗技术、病情转归等资料.结果 H7N9组基础疾病和进入ICU接受治疗的比例均高于H1N1组.H7N9组发病初期伴有呼吸困难和气促、呼吸窘迫综合症的发生率均高于H1N1组.H7N9组患者有创机械通气治疗和死亡率均高于H1N1组.两组流感患者主要病理表现为肺间质和实质损伤,其基本CT影像改变是肺内磨玻璃密度影和肺实变密度影.H7N9组患者胸腔积液和网格状密度增高表现多于H1N1组（双侧P＜ 0.05）.结论 人感染H7N9确诊病例与甲型H1N1重症肺炎的治疗新技术应用有创侵入性治疗技术,需要保护机体进一步损伤,抗生素治疗需注重中成药联合应用,加快治愈效果和增强免疫机能防御功能.运用基因检测方法,进行针对病因精准治疗.与H1N1组患者相比,H7N9病毒易引起肺炎、ARDS、多脏器衰竭等严重疾病,患者ICU入住率和死亡率高.

2株H7N9亚型重组禽流感病毒的生物学特性和免疫原性研究

为评估经反向遗传构建的H7N9亚型重组禽流感病毒(AIV)H7-Re1株和H7-Re2株的生物学特性及免疫原性,本研究将这2株病毒分别以10^4倍稀释接种10日龄SPF鸡胚后,36℃培养,观察鸡胚存活情况并检测病毒HA效价,结果显示96 h时,2株病毒接种的鸡胚全部存活,培养至72 h时其HA效价均为9 log2,均显著高于亲本分离株。测定2株病毒的静脉内接种致病指数(IVPI),结果显示均为0。将2株病毒分别以10^6 EID50剂量鼻腔内接种5周龄SPF鸡,进行致病性试验,结果显示,接种后14 d内,2株病毒接种鸡均无临床症状,也不排毒。以2株病毒为种毒分别制备油乳剂灭活疫苗,以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡后3周时检测免疫鸡血清中HI抗体,结果显示,两种疫苗免疫鸡平均HI效价均可达到8.0 log2。于免疫后21 d,H7-Re1株免疫组鸡分别攻击10^6 EID50的H7N9亚型低致病力AIV(PG/SHH/S1069/13株)和10^5 EID50的高致病力AIV(CK/GX/SD098/17株),进行攻毒试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均全部存活,且无发病和排毒出现。H7-Re2株免疫组鸡于免疫后21 d分别以10^5 EID50的剂量进行高致病力H7N9亚型AIV(CK/GX/SD098/17株)和H7N2亚型AIV(DK/FJ/SE0195/18株)的攻毒保护试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒。以上结果表明,以H1N1亚型A/Puerto Rico/8/34株病毒为内部基因供体、经反向遗传学方法构建的H7-Re1株和H7-Re2株均具有生长滴度高、生物安全性高和免疫原性好的特点。本研究为H7N9亚型禽流感疫苗的研制和应用奠定了基础。

H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。

甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白(NS1)真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白。首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒(A/Anhui/3/2013(H7N9))的总RNA,通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全长基因,然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中,通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达。结果表明成功克隆了NS1全长基因,构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T细胞中转染表达,Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达。该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白,为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。

H5N1和H7N9亚型双价灭活流感疫苗对鹌鹑及鸽子的免疫原性

为评价重组流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对鹌鹑和鸽子的安全性及免疫效果,2017年12月—2018年6月,采用哈尔滨维科生物技术开发公司生产的重组流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗,对鹌鹑和肉鸽,在25日龄首免,46日龄二免(鹌鹑和肉鸽的剂量分别为0.3 mL和1 mL),观察禽群临床表现,定期采集血清测定抗体效价。结果显示:鹌鹑首免后21 d,H5和H7亚型HI抗体效价均达到高峰,分别为(7.7±1.3)log2和(8.5±1.3)log2,抗体合格率大于70%的持续期约为35 d;二免后7d,H5和H7亚型抗体效价均达到高峰,效价分别为(9.7±0.9)log2和(10.3±0.9)log2,H5和H7亚型抗体合格率大于70%的持续期分别约为147 d和175 d。鸽子首免后21 d,H5和H7抗体效价也均到达高峰,分别为(9.8±0.8)log2和(10.4±1.1)log2,两种亚型抗体合格率大于70%的持续期均超过181 d;加强免疫后7 d,H5和H7抗体效价也均达到高峰,效价分别为(10.2±1.0)log2和(10.7±0.9)log2,189 d后效价分别为(5.4±1.3)log2和(6.1±1.5)log2,合格率分别为96.7%和100%。临床观察,未发现该疫苗有严重免疫不良反应。结果表明,(H5+H7)二价灭活疫苗对鹌鹑和鸽子安全有效。生产中推荐:鹌鹑25日龄首免,46日龄和6月龄各加强免疫1次,剂量为0.3 m L;鸽子25日龄首免,以后每隔6个月加强免1次,剂量为1 m L。

H7N9病毒的M1基因序列分析及原核表达

目的 克隆H7N9禽流感病毒M1并在原核细胞中表达,为进一步研究其生物学特性、免疫学功能及血清学检测奠定基础。方法 用PCR方法从禽流感上海分离株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）c DNA扩增M1基因,并克隆到载体p MD18-T中。经测序证实后,用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体p ET28a,并转化E.coli BL21（DE3）菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定及western blot检验。结果 （1）经PCR、测序和酶切鉴定,成功克隆了禽流感H7N9 M1基因;（2）经IPTG诱导的重组质粒p ET28a-M1表达出约为28 k Da的融合蛋白,与预期结果相符;（3）对H7N9型禽流感M1基因序列分析表明,与2013年暴发的H7N9型禽流感病毒M1基因核苷酸序列同源性在95.4%-100%,与2006-2011年间暴发的H7N9型流感病毒M1基因序列同源性在69.0%-89.6%,2013年感染人的H7N9型流感病毒与此前暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支。结论 成功克隆了禽流感H7N9病毒的M1基因,并在E.coli中得以表达。

一起鸡感染H7N9流感病毒变异株的调查

[目的 ]通过对鸡H7N9流感病毒(变异株)感染临床解剖特征的描述以及H7N9流感病毒变异株来源的探讨,为今后该病的临床诊断以及防控提供借鉴。[方法 ]采用流行病学调查、临床解剖、实时荧光定量RTPCR、病毒分离测序等方法。[结果 ]病鸡外观症状与解剖症状均明显;H7、H9流感病毒核酸检测阳性;该分离株与2013年分离毒株(A/Anhui/1/2013(H7N9)的HA、NA基因核苷酸同源性分别为97.8%~97.9%、97.8%。[结论 ]鸡的感染死亡是由H7N9流感病毒(变异株)引起的;该变异株引发疫情迅猛,传染速度快,致死率高,应加强对其防控。