广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

H9N2 AIV灭活疫苗免疫SPF鸡攻毒后肺组织免疫相关基因表达变化研究

[目的]本试验旨在探究H9N2亚型禽流感病毒攻击对H9灭活疫苗免疫SPF鸡呼吸系统的影响。[方法]选用36只3周龄SPF鸡,随机分为对照组(Con)、攻毒组(Flu)、免疫后攻毒组(Vac+Flu)。以每只0.4 mL剂量免疫接种H9灭活疫苗,3周后以10~6 EID_(50)的病毒量进行攻毒,采集拭子、血清、气管、肺组织等样品,通过血凝抑制(HI)试验、RT-PCR、荧光定量PCR(qPCR)等方法检测血清中HI抗体滴度、肺脏流感病毒M基因拷贝数以及免疫相关基因CD4、CD8、GATA3、T-bet、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ、Perforin、Granzyme、FasL、Fas等的表达量;并利用HE染色、免疫组织化学的方法观察气管、肺脏的病理变化及病毒特异性抗原NP蛋白的分布特征。[结果]HI试验结果显示,SPF鸡疫苗免疫后可产生较高的H9N2 AIV抗体效价。免疫保护试验和RT-PCR结果显示,SPF鸡疫苗免疫后攻毒仍能检测到机体排毒和流感病毒M基因在肺脏组织中的表达。HE染色和免疫组化结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够明显减轻SPF鸡气管和肺脏的病理损伤,降低气管、肺脏中的病毒载量。荧光定量PCR结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够提高SPF鸡肺脏中Th1、Th2细胞因子分泌水平,促进穿孔素/颗粒酶途径相关基因表达进而增强肺脏中细胞毒性反应。[结论]H9N2疫苗免疫鸡感染H9病毒后虽然仍存在排毒现象,但其抗病毒免疫系统活跃、其主要器官病毒载量降低,建议按照流感疫苗免疫程序进行免疫接种,提高对流感的防控水平。

YTHDF1对缺氧复氧损伤后H9c2心肌细胞凋亡及氧化应激的影响

目的探讨含YTH域家族蛋白1(YTHDF1)对缺氧复氧(H/R)条件下H9c2细胞凋亡和氧化应激的影响。方法用H9c2细胞构建H/R模型,并用YTHDF1小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒转染细胞,采用MTT比色法测定细胞活力,并用赫斯特染色及流式细胞术测定细胞凋亡及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和细胞培养基上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western blot法测定细胞中YTHDF1、cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平,比较对照组(control组)、H/R组、YTHDF1基因干扰和过表达组H9c2细胞凋亡和氧化损伤情况。结果H/R损伤后LDH活性和MDA含量明显升高(P<0.05),SOD活性和细胞活力显著降低(P<0.05),H/R处理后H9c2细胞中YTHDF1的蛋白水平均显著升高(P<0.05);YTHDF1干扰减轻了H/R损伤引起的形态学变化,YTHDF1过表达增加了H/R损伤引起的细胞形态变化;H/R损伤处理后cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白表达显著高于control组(P<0.05);H/R+YTHDF1-siRNA组cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平显著低于H/R组(P<0.05),H/R+pcDNA3.1-YTHDF1组cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平显著高于H/R组(P<0.05)。结论下调YTHDF1可以抑制H/R处理的H9c2细胞cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平的上调并降低H/R处理的心肌细胞氧化损伤。

山茶油对H_(2)O_(2)诱导大鼠H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用

目的:探讨山茶油对H_(2)O_(2)诱导大鼠H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。方法:CCK8法检测不同浓度H_(2)O_(2)处理H9C2心肌细胞后细胞存活率,以正常培养的细胞为空白对照组,以200μmol/L H_(2)O_(2)处理细胞24 h,构建氧化应激损伤模型作为模型组。分别用1%,0.1%,0.01%浓度的山茶油预处理细胞24 h后,加入H_(2)O_(2)作用24 h作为实验组。利用β-半乳糖苷酶衰老染色实验,线粒体膜电位实验,EdU细胞增殖染色实验及划痕实验来观察各组细胞衰老,线粒体膜电位,增殖凋亡,迁移的变化。利用试剂盒检测各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量。结果:不同浓度H_(2)O_(2)处理H9C2心肌细胞后,细胞活力均受到抑制,且与H_(2)O_(2)浓度正相关(P<0.01)。与空白对照组相比,H_(2)O_(2)模型组细胞衰老阳性率、MDA含量和LDH活性增加(P<0.01);线粒体膜电位、细胞增殖率、迁移率、SOD活性下降(P<0.01)。与H_(2)O_(2)模型组相比,实验组细胞衰老阳性率(P<0.05)、MDA含量和LDH活性降低(P<0.05);线粒体膜电位增加、细胞增殖率和迁移率增加(P<0.05)。结论:山茶油可显著抑制H9C2细胞的氧化应激损伤,发挥心肌细胞保护作用。

交趾黄檀新黄酮类成分及其抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性研究

目的研究交趾黄檀Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness的新黄酮类成分及其抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性。方法交趾黄檀70%乙醇提取物采用硅胶、Sephadex LH-20、反相制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用CCK-8法检测其对H9c2心肌细胞的活性及对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用,并分析其构效关系。结果从中分离得到12个化合物,分别鉴定为阔叶黄檀酚(1)、5-O-methyllatifolin(2)、mimosifoliol(3)、5-O-methydalbergiphenol(4)、dalbergiphenol(5)、cearoin(6)、2,4-dihydroxy-5-methoxy-benzophenone(7)、2-hydroxy-4,5-dimethoxybenzophenone(8)、melannoin(9)、2,2′,5-trihydroxy-4-methoxybenzophenone(10)、黄檀素(11)、4-甲氧基黄檀醌(12)。黄檀酚及黄檀内酯类化合物对H9c2细胞毒性较小,黄檀酚类化合物抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性较强。结论化合物8为新天然产物,化合物4、9为首次从该植物中分离得到。黄檀酚类化合物可能是抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤的主要新黄酮类成分。

神经介素B及受体NMBR和PD-L1在H9N2亚型流感病毒感染过程中的相互作用研究

神经介素B(NMB)及其G蛋白偶联受体(NMBR)发挥的抗甲型流感病毒免疫反应,以及甲型流感病毒感染诱导细胞程序性死亡配体1(PD-L1)高表达均与NF-κB信号通路有直接关系,而NF-κB信号通路的激活受ERK信号通路的调控。为深入探究NMB与NMBR调节H9N2亚型流感病毒感染诱导PD-L1上的作用,本研究以H9N2亚型流感病毒为模式毒株,基于NMBR干扰和过表达细胞系、PD-L1干扰和过表达细胞系以及C57BL/6小鼠,采用RT-PCR和Western blot方法分析NMB与NMBR对PD-L1表达变化以及ERK磷酸化的影响。结果显示:H9N2亚型流感病毒感染诱导的NMBR和PD-L1表达之间存在着负调控的关系,外源性NMB可以有效激活小鼠体内NMBR的表达,进而抑制PD-L1表达,NMB与NMBR也能影响H9N2感染诱导的ERK磷酸化水平。综上,H9N2亚型流感病毒感染诱导表达的NMB与NMBR通过ERK信号通路调节PD-L1的表达而发挥抗流感病毒作用,将为深度剖析宿主-甲型流感病毒之间的互作关系提供新的科学依据。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

6株H9N2亚型禽流感病毒分子特征及遗传演化分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的分子变化特征及其跨物种传播的可能性,对实验室保存的6株H9N2亚型AIV的8个基因片段进行了序列测定及遗传演化分析,并且对6株病毒与选取的代表毒株进行了HA和NA同源性及关键氨基酸位点分析。结果显示,分离的6株病毒均为欧亚系,其中3株为G57基因型;4株病毒的HA蛋白发生了Q226L突变,2株病毒的HA发生了A190V突变。HA和NA均有增加或缺失的潜在糖基化位点。6株病毒的NA茎部均有62~64位的缺失,红细胞结合位点431~433较为保守,而368和369位变化较大。综上,6株病毒为低致病性AIV,HA和NA均含有哺乳动物适应性突变,增大了其跨宿主传播的风险。研究结果为我国H9N2亚型AIV的进化提供了参考依据,为其综合防控提供了理论指导。

PPARγ低表达对Ang Ⅱ诱导H9c2心肌细胞肥大的影响

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ低表达对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞肥大(MCR)的作用及可能机制。方法 采用H9c2心肌细胞,拟高糖培养基与药物AngⅡ构建MCR模型。采用AD-PPARγRNAi重组腺病毒载体,感染到H9c2心肌细胞中,将实验分为对照组、Vehicle组、AD-PPARγRNAi组、MCR组、MCR+Vehicle组、MCR+AD-PPARγRNAi组。形态学上采用苏木素-伊红(HE)染色法观察MCR时形态大小的变化。通过Western印迹法检测PPARγ、肌球蛋白重链(MYH)7B、心钠肽(ANP)蛋白表达情况。结果 HE染色结果显示,MCR组与对照组比较、MCR+Vehicle组与Vehicle组比较、MCR+AD-PPARγRNAi组与AD-PPARγRNAi组比较,H9c2细胞核形态大小均变大。Western印迹结果显示:与对照组比较,MCR组MYH7B、ANP表达明显增加(P<0.05)。AD-PPARγRNAi重组腺病毒感染H9c2心肌细胞后,AD-PPARγRNAi组与对照组和Vehicle组比较,PPARγ表达明显降低,MYH7B、ANP表达明显增加(P<0.05);MCR+AD-PPARγRNAi组与MCR组和MCR+Vehicle组比较,PPARγ表达明显降低,MYH7B、ANP表达明显增加(P<0.05)。结论 经AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞MYH7B、ANP表达增加,AD-PPARγRNAi重组腺病毒感染H9c2心肌细胞后PPARγ表达下降且MYH7B、ANP表达增加。推测由AngⅡ诱导MCR后PPARγ低表达干预可能影响心肌细胞进一步增厚,且PPARγ高表达可能逆转心肌肥厚。

一例种鸡肿头综合症与H9亚型禽流感混感的病例报告

禽肺病毒又称火鸡鼻气管炎病毒,属于副黏病毒科肺病毒亚科肺病毒属,对鸡的感染主要伴发细菌性的感染,多会引起病鸡面部,头部肿胀因此称为肿头综合症。2023年4月9日河北某鸡场230日龄的高峰产蛋肉种鸡65724只,由于气温变化剧烈,鸡群遭遇冷应激,造成严重的死亡,降蛋损失,全群死亡鸡只5933只,全场平均降蛋幅度11.8%。大群主要表现呼吸道急剧加重,采食量下降,精神沉郁,产蛋率下降,肿头,流泪,病鸡出现神经症状。经病原学和血清学诊断,确诊为肿头综合症和H9亚型禽流感混感。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

丙泊酚后处理在高糖环境下改善H9c2心肌细胞缺氧/复氧诱导的凋亡和自噬

目的探讨丙泊酚后处理(propofol postconditioning,P-Post C)在高糖环境下对H9c2心肌细胞缺血/复氧诱导的凋亡和自噬的改善作用。方法2023年4月于上海市奉贤区中心医院开展实验,将大鼠心脏来源的H9c2细胞暴露于高糖48 h,然后在不存在或存在不同浓度的P-Post C后处理的情况下,在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)。细胞分组:NC组、HG组、NC+H/R组、HG+H/R组、HG+H/R+P12.5组、HG+H/R+P25组、HG+H/R+P50组、HG+H/R+P100组和HG+H/R+P25+Brusatol组。确定丙泊酚的浓度后,在使用或不使用Nrf2/HO-1通路抑制剂的情况下,对H9c2细胞进行H/R和P-Post C处理,以探索它们在P-Post C介导的高糖下对凋亡和自噬细胞死亡的保护中的作用。结果结果显示,含或不含H/R的高糖降低了H9c2细胞的活力,增加了乳酸脱氢酶的释放和活性氧的产生,所有这些都被P-Post C显著逆转,尤其是在25μmol/L(P25)浓度下(P<0.05)。此外,发现丙泊酚(P25)降低H9c2细胞的凋亡和自噬,同时增加Nrf2和HO-1的表达(P<0.05)。丙泊酚(P25)对H/R损伤的保护作用通过使用Nrf2/HO-1通路抑制剂而逆转(P<0.05)。结论P-Post C通过上调高糖状态下的Nrf2/HO-1通路活性,减轻了H/R损伤诱导的H9c2心脏细胞凋亡和自噬。

2022年四川省达州市H9亚型禽流感病毒监测与分析

为掌握达州市H9亚型禽流感病毒(AIV)的流行特征,于2022年在达州市128个乡镇的855个场点(家禽养殖场109个、活禽交易市场87个、散养户609个、活禽屠宰点50个)采集10120份样品,采用荧光定量RT-PCR法进行H9亚型AIV核酸检测。结果显示,达州市H9亚型AIV总体场点阳性率为3.27%(28/855),总体样品阳性率为0.41%(41/10120),其中活禽交易市场、屠宰点、养殖场、散养户的场点阳性率分别为17.24%、4.00%、1.83%、1.48%;鸡、鸭、鹅、鸽样品的场点阳性率分别为4.71%、3.37%、0、0;咽喉和泄殖腔拭子、环境样品的样品阳性率分别为0.60%、0.19%;不同县别的场点阳性率为0.78%~10.00%,样品阳性率为0.13%~0.74%,各县(市、区)均有阳性样品检出。结果表明,达州市H9亚型AIV低水平流行,防控效果较好,但其污染面广,主要在活禽交易市场与鸡群中流行,是监测与防控的重点。

金银花提取物对脂多糖诱导H9c2心肌细胞的炎症、氧化损伤和凋亡的作用机制

本研究旨在探究金银花提取物对脂多糖诱导下H9c2心肌细胞炎症、氧化损伤和凋亡的作用机制。方法 使用H9c2心肌细胞作为研究对象,分为对照组、脂多糖诱导组和金银花提取物处理组。然后通过对炎症相关因子表达水平、氧化损伤标志物和凋亡相关因子表达水平的检测结果对细胞的炎症反应、氧化损伤和凋亡情况进行进一步的评估。结果 与脂多糖诱导组相比,金银花提取物处理组显示出明显的抑制炎症反应、减轻氧化损伤和凋亡的作用。金银花提取物处理组中炎症相关因子表达水平显著降低,氧化损伤标志物水平较低,并且凋亡相关因子表达水平明显减少。结论 金银花提取物对脂多糖诱导的H9c2心肌细胞具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用。通过研究结果可以得出,金银花提取物可能成为预防和治疗心肌细胞炎症、氧化损伤以及凋亡相关疾病的潜在药物。

基于悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)安全性和免疫产生期研究

为探讨悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)(以下简称二联灭活疫苗)的安全性和免疫产生期,试验用新城疫病毒(NDV)La Sota株和H9亚型禽流感病毒(AIV)BX13株分别接种BHK-21和MDCK悬浮细胞,收获抗原液,制备二联灭活疫苗;采用1 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡进行二联灭活疫苗的安全性试验;以0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIVHI抗体,并于免疫后21日龄攻毒进行免疫保护试验和免疫产生期试验。结果显示:二联灭活疫苗对SPF鸡安全,鸡只无不良反应,疫苗吸收良好;各剂量组免疫后抗体水平均逐渐升高,免疫后21 d NDV HI效价为6.1~8.5 log2,AIV HI效价为7.5~11.2 log2;免疫后21 d,0.02 mL/只剂量组对两种毒株的攻毒保护率均为9/10,其余剂量组均为10/10保护。研究表明,二联灭活疫苗对SPF鸡安全,以0.1 mL/只的剂量免疫SPF鸡21 d可获得对NDV和H9 AIV的有效抵抗。

2019—2020年9株H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析及候选疫苗株筛选

为了解近年来H9N2亚型禽流感病毒的分子特征和抗原变异情况,本研究对选自2019—2020年的9株H9N2亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列进行分析,进一步利用交叉血凝抑制试验和中和试验对抗原性进行分析,并以此筛选出候选疫苗株,开展免疫原性和攻毒保护试验研究。9株病毒HA基因核苷酸同源性为91.2%~98.9%,表明这些毒株之间HA基因分化明显。9株病毒HA蛋白裂解位点序列均为RSSR,符合低致病性禽流感病毒分子特征。所有9株病毒HA均含有7个潜在的糖基化位点。9株病毒HA关键受体结合位点的234位氨基酸由谷氨酰胺变为亮氨酸,提示这些毒株具有结合α2,6-Sialidase受体的能力。交叉血凝抑制试验显示各毒株之间出现最大64倍的抗原性差异,交叉中和试验显示各毒株之间出现最大1024倍的抗原性差异。根据中和试验结果,利用AntigenMap制作抗原图谱,可以看出9株病毒可以分为2个主要抗原群。筛选的Y2432毒株制备灭活疫苗免疫鸡群后21 d,针对同源毒株平均血凝抑制(HI)抗体效价达到13.6 log_2,使用同源毒株和异源毒株进行攻毒,保护率均为100%。Y2432免疫SPF鸡,14 d即可产生高水平抗体,最高可达到14.4 log_2,且抗体可维持140 d以上。筛选的候选疫苗株免疫原性和免疫保护效果较好,为预防H9N2亚型禽流感的流行提供了重要技术储备。

H9亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异快、传染性强,由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果,导致H9N2亚型禽流感时有发生。为研发具有广谱保护性的H9亚型禽流感疫苗,本研究利用生物信息技术,对H9亚型AIV HA基因序列进行分析,设计获得HA基因序列。将HA基因构建于杆状病毒表达系统,表达的重组HA蛋白血凝效价为1×2^(12),与不同分支H9亚型AIV阳性血清具有良好的交叉反应活性。将重组蛋白制备成疫苗(rHA疫苗)免疫10日龄雏鸡,免疫后28 d将不同亚分支的H9亚型AIV流行毒株115和YZ株分别以1×10^(6)EID_(50)(半数鸡胚感染量)感染试验鸡,rHA疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组。本研究结果表明H9亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景,可以用于防控H9 AIV感染。

滋膵通脉饮对高糖诱导大鼠H9c2心肌细胞自噬和凋亡的影响及机制

目的 探讨滋膵通脉饮对高糖诱导的大鼠H9c2心肌细胞自噬和凋亡的影响及机制。方法 将20只无特定病原级Sprague Dawley大鼠按随机数字表法分为空白血浆组和滋膵通脉饮组,每组10只。滋膵通脉饮组大鼠每天给予10 mL·kg^(-1)滋膵通脉饮灌胃,空白血浆组大鼠给予等剂量灭菌超纯水灌胃,连续灌胃7 d,采集腹主动脉血,分离血浆备用。取对数生长期H9c2心肌细胞,按随机数字表法分为正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组,分别加入稀释后的胎牛血清、空白血浆组血浆及滋膵通脉饮组血浆,每组设置体积分数5%、10%、15%的浓度梯度,应用细胞计数试剂盒-8法检测各组H9c2心肌细胞增殖情况,筛选最佳含药血浆浓度。取对数生长H9c2细胞,按随机数字表法分为正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组,正常对照组细胞不加任何药物干预,高糖诱导组细胞加33.3 mmol·L^(-1) D-葡萄糖和体积分数10%空白血浆组血浆,高糖诱导+中药含药血浆组细胞加33.3 mmol·L^(-1) D-葡萄糖和体积分数10%滋膵通脉饮组血浆,高糖诱导+恩格列净组细胞加33.3 mmol·L^(-1)的D-葡萄糖和0.01μmol·L^(-1)恩格列净;给药24 h后,使用细胞毒性比色法检测各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中自噬和凋亡相关蛋白p62、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Bcl-2的表达。结果 体积分数5%、15%浓度时,滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力显著低于正常对照组和空白对照组(P<0.05);正常对照组与空白对照组H9c2细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。体积分数10%浓度时,正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力比较差异无统计学意义(F=0.110,P>0.05)。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率显著低于高糖诱导组(t=43.527、23.836、21.617,P<0.01);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞凋亡率显著高于正常对照组(t=14.933、11.723,P<0.05);高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率比较差异无统计学意义(t=1.995,P>0.05)。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH释放率显著低于高糖诱导组(t=58.660、31.408、26.557,P<0.01);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞LDH释放率显著高于正常对照组(t=14.167、11.740,P<0.05);高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH释放率比较差异无统计学意义(t=1.801,P>0.05)。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中p62、Bax表达水平显著低于高糖诱导组,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2表达水平显著高于高糖诱导组(P<0.05);高糖诱导组H9c2细胞中Bcl-2/Bax显著低于正常对照组和高糖诱导+中药含药血浆组(P<0.05);高糖诱导组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中Bcl-2/Bax比较差异无统计学意义(P>0.05);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞中p62、Bax显著高于正常对照组,Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2/Bax显著低于正常对照组(P<0.05)。高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2表达水平及Bcl-2/Bax比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 滋膵通脉饮可激活高糖诱导H9c2心肌细胞自噬,抑制H9c2细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤。

3,3'-二吲哚甲烷对脂多糖诱导的H9c2细胞氧化应激和增殖的影响

目的观察3,3'-二吲哚甲烷(DIM)对脂多糖(LPS)诱导H9c2细胞增殖及氧化应激的影响。方法2022年10—12月于武汉大学人民医院代谢与相关慢病湖北省重点实验室进行实验,采用LPS(10 mg/ml)刺激H9c2细胞,并用不同浓度的DIM[10、20、30μmol/L]进行干预。活细胞计数试剂盒(CCK-8)检测H9c2细胞增殖能力;通过检测细胞内活性氧基团(ROS)水平并分析LPS对H9c2细胞的毒性作用。结果CCK-8结果提示,DIM对H9c2细胞活性无显著影响(P>0.05),LPS可提高H9c2细胞的增殖活性(P<0.01),当DIM与LPS同时作用时,可明显降低LPS对H9c2细胞增殖活性的提升(LPS+DIMⅠ组:F=7.451,P=0.002,LPS+DIMⅡ组:F=8.822,P=0.001,LPS+DIMⅢ组:F=10.460,P=0.001);LPS可增加H9c2细胞内ROS水平(P<0.05),当DIM与LPS同时作用时,ROS水平显著降低(LPS+DIMⅠ组:F=27.440,P<0.001,LPS+DIMⅡ组:F=14.060,P<0.001,LPS+DIMⅢ组:F=18.760,P<0.001),且随着药物浓度增加下降趋势更明显(P<0.01)。结论DIM可通过抑制LPS诱导的H9c2细胞氧化应激并改善H9c2细胞的增殖活性。