禽流感H5和H9亚型基因探针的制备

参照GeneBank数据库上H5N1和H9N2 AIV的HA基因序列,选取保守区域,设计了两对引物,分别用于扩增HA基因,产物纯化回收得到180bp和285bp cDNA片段,采用随机引物法Digxigenin-11-dUTP标记得到探针H5PR和H9PR,通过斑点杂交检测,结果表明探针的灵敏度高和特异性好,可以进行相关性试验。

H_9N_2亚型AIV HA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。

表达禽流感H5N1血凝素抗原(HA)和H9N2血凝素抗原(HA)融合基因重组腺病毒二价苗的构建

为了构建禽流感病毒H5N1亚型禽流感病毒HA和H9N2亚型禽流感HA融合基因表达的重组腺病毒。根据流行病学调查并参考文献研究结果,合成了优势流行H5N1和H9N2的保护性抗原HA基因的融合基因片段,并将该融合基因片段克隆到在pUC57载体,命名为pUC-57H5H9HA。该融合基因片段经特异酶切后与腺病毒穿梭质粒pDC315连接,获得携带目的融合基因腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA;将该重组穿梭质粒与AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHGlox(delta)E1,3Cre)经Cre/loxP酶切重组,构建成重组腺病毒(rAd-H5H9HA);Ad-H5H9HA感染293细胞后,扩增病毒基因,纯化病毒及检测病毒滴度。PCR鉴定及基因测序分析,H5N1HAH9N2HA(H5H9HA)融合基因表达的重组腺病毒载体构建成功;经过重组腺病毒r Ad-H5H9HA免疫SPF鸡后的抗体检测,证实了重组腺病毒r Ad-H5H9HA诱导了H5N1和H9N2的特异抗体,而且抗体水平达到了国家免疫标准。本研究成功构建的重组腺病毒rAd-H5H9HA,可以作为预防H5N1和H9N2两个亚型病毒的二价疫苗使用,为将来禽流感的预防控制提供了一种新的可能。