鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗免疫效果研究

为探讨制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗(以下简称新支流滑四联灭活疫苗)免疫效果,试验采用新城疫病毒(NDV)La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞,用易感鸡胚增殖传染性支气管炎病毒(IBV)M41株,H9亚型禽流感病毒(AIV)ML01株接种MDCK-sc悬浮细胞,用改良Frey氏培养基发酵培养鸡滑液囊支原体(MS)ML-MS1株,收获抗原液,制备新支流滑四联灭活疫苗,并对疫苗进行安全性和效力测定;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIV(H9亚型)HI抗体,并于免疫后21 d进行NDV和AIV攻毒;30日龄SPF鸡首免H120株,免疫后21 d采血测定IBV HI抗体效价,并以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量进行二免,免疫后7、14、21、28 d采血测定IBV HI抗体;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21、30 d采血测定MS ELISA抗体,并于免疫后30 d进行MS攻毒。结果显示:制备的新支流滑四联灭活疫苗安全性良好、效力合格;免疫后21 d NDV HI效价为6.6~8.8 log2,AIV HI效价为7.0~9.7 log2;免疫后28 d IBV HI效价为5.6~7.8 log2,且二免是首免的3.2~14.9倍;免疫后30 d MS ELISA效价为3 164~6 847;攻毒试验结果显示,0.05 mL/只剂量组对ML-MS1攻毒保护率为80%(8/10),其余组均为100%(10/10)保护。研究表明,新支流滑四联灭活疫苗对SPF鸡安全、有效,以0.1 mL/只剂量免疫SPF鸡可获得较好的免疫效果。

H9N2 AIV灭活疫苗免疫SPF鸡攻毒后肺组织免疫相关基因表达变化研究

[目的]本试验旨在探究H9N2亚型禽流感病毒攻击对H9灭活疫苗免疫SPF鸡呼吸系统的影响。[方法]选用36只3周龄SPF鸡,随机分为对照组(Con)、攻毒组(Flu)、免疫后攻毒组(Vac+Flu)。以每只0.4 mL剂量免疫接种H9灭活疫苗,3周后以10~6 EID_(50)的病毒量进行攻毒,采集拭子、血清、气管、肺组织等样品,通过血凝抑制(HI)试验、RT-PCR、荧光定量PCR(qPCR)等方法检测血清中HI抗体滴度、肺脏流感病毒M基因拷贝数以及免疫相关基因CD4、CD8、GATA3、T-bet、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ、Perforin、Granzyme、FasL、Fas等的表达量;并利用HE染色、免疫组织化学的方法观察气管、肺脏的病理变化及病毒特异性抗原NP蛋白的分布特征。[结果]HI试验结果显示,SPF鸡疫苗免疫后可产生较高的H9N2 AIV抗体效价。免疫保护试验和RT-PCR结果显示,SPF鸡疫苗免疫后攻毒仍能检测到机体排毒和流感病毒M基因在肺脏组织中的表达。HE染色和免疫组化结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够明显减轻SPF鸡气管和肺脏的病理损伤,降低气管、肺脏中的病毒载量。荧光定量PCR结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够提高SPF鸡肺脏中Th1、Th2细胞因子分泌水平,促进穿孔素/颗粒酶途径相关基因表达进而增强肺脏中细胞毒性反应。[结论]H9N2疫苗免疫鸡感染H9病毒后虽然仍存在排毒现象,但其抗病毒免疫系统活跃、其主要器官病毒载量降低,建议按照流感疫苗免疫程序进行免疫接种,提高对流感的防控水平。

基于悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)安全性和免疫产生期研究

为探讨悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)(以下简称二联灭活疫苗)的安全性和免疫产生期,试验用新城疫病毒(NDV)La Sota株和H9亚型禽流感病毒(AIV)BX13株分别接种BHK-21和MDCK悬浮细胞,收获抗原液,制备二联灭活疫苗;采用1 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡进行二联灭活疫苗的安全性试验;以0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIVHI抗体,并于免疫后21日龄攻毒进行免疫保护试验和免疫产生期试验。结果显示:二联灭活疫苗对SPF鸡安全,鸡只无不良反应,疫苗吸收良好;各剂量组免疫后抗体水平均逐渐升高,免疫后21 d NDV HI效价为6.1~8.5 log2,AIV HI效价为7.5~11.2 log2;免疫后21 d,0.02 mL/只剂量组对两种毒株的攻毒保护率均为9/10,其余剂量组均为10/10保护。研究表明,二联灭活疫苗对SPF鸡安全,以0.1 mL/只的剂量免疫SPF鸡21 d可获得对NDV和H9 AIV的有效抵抗。

禽流感H_9亚型油乳剂灭活疫苗的改进

用新引进的 6株禽流感病毒 (AIV )H9亚型和现制苗用的AIV H9毒株分别制备AIV H9、AIV H5、NDV二联三价油乳剂灭活疫苗 ,免疫 5日龄和 10日龄雏鸡 ,于免疫当日直至 80日龄鸡出栏期间定期采血 ,用HI法检测相应的AIV H9、AIV H5和NDV抗体。结果表明 ,10日龄免疫鸡的AIV H9抗体效价最高 ,5日龄和 10日龄免疫鸡的AIV H5抗体效价差别不明显 ;用引进的 3号AIV H9毒株制备的联苗对 10日龄雏鸡免疫后 2 0d产生AIV H9保护性抗体 ,一直持续到 80日龄以上 ,期间的抗体平均效价为 6 .72 (lb) ,而现制苗用的AIV H9毒株制备的联苗免疫力较差 ;现制苗用的AIV H5毒株制备的联苗免疫效力仍较好 ;分别接种 0 .2 5、0 .30mL/只联苗的雏鸡AIV H5抗体效价没有明显差别 ,而AIV H9抗体效价以接种 0 .30mL/只剂量的为高 ;不同日龄、不同免疫剂量的试验鸡NDV抗体效价没有明显差异。

禽流感(H5、H9亚型)二价油乳剂灭活疫苗试验研究

本品系用A型禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/72420/96(LPAI-H5N2)株及A/Chicken/Shanghai/1/98(H9N2)株分别接种易感鸡胚、收获感染胚液、超滤浓缩后经甲醛溶液灭活 ,加油佐剂混合乳化制成的油乳剂灭活疫苗。疫苗用4周龄SPF鸡作安全试验 ,每只鸡肌肉注射2ml ,结果表明试验鸡均无全身症状和局部病变 ,证明疫苗安全性良好。取疫苗一羽份免疫4周龄SPF鸡作效力检验 ,免疫鸡全部获得保护 ,对照鸡全部感染或死亡。经不同免疫剂量测定 ,证明一羽份疫苗中至少含有8个免疫剂量。免疫干扰试验证明两种抗原具有免疫协同作用。

禽流感(H_9亚型)油乳剂灭活疫苗的血凝抑制(HI)抗体动态变化的研究

从市场上随机购得不同厂家各两批次的商品化禽流感(H9)油乳剂灭活疫苗,按瓶签说明免疫禽流感母源抗体为阴性的蛋鸡。当疫苗抗体下降至5log2左右时部分鸡再二免,并做田间试验。结果表明,免疫1周出现血清抗体,并逐日上升,3周达高峰。首次免疫8周后抗体下降至5log2左右,二次免疫15周后抗体下降至5log2左右。这四批疫苗的免疫原性较高,安全可靠,两次免疫保护期可保护至开产后。

禽流感(H9亚型)油乳剂灭活疫苗的研究

将 H9亚型禽流感病毒尿囊液 ,经甲醛灭活 ,以矿物油为佐剂制成油乳剂灭活疫苗。疫苗物理性状良好 ,接种鸡无不良反应 ,接种疫苗后 1 4d,禽流感病毒 HI GMT(Log2 )为 7.7～ 7.8,2 1 d为 8.9～ 9.3 ,于接种疫苗后 1 4、2 1、3 0、6 0 d攻击同型禽流感病毒 ,接种疫苗鸡全部获得保护。现地实验取得了良好地免疫效果 ,证明制备的油乳剂灭活疫苗安全 ,免疫原性良好。

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

H9亚型禽流感病毒分离鉴定及鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病三联灭活疫苗对其免疫保护效果研究

【目的】研究鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)(简称:新流腺)三联灭活疫苗(La Sota株+BX13株+DC株)对禽流感病毒(AIV)流行毒株的免疫保护效果,为新流腺三联灭活疫苗的研发提供数据支撑。【方法】本研究对2019-2022年分别对从河北石家庄、北京密云、河北衡水、广西南宁发病鸡群中采集的病料进行AIV分离鉴定;利用MegAlign软件分析BX13株和2019-2022年分离株之间的相似性及亲缘关系;采用新流腺三联灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d测定H9亚型AIV HI抗体,同时用同源BX13株和本试验中AIV分离株进行攻毒试验,检测新流腺三联灭活疫苗对H9亚型AIV流行毒株的保护效果。【结果】2019-2022年从河北、北京和广西发病鸡群中分离获得4株AIV,均为H9亚型AIV,分别命名为SJZ19、MY20、HS21和NN22株;BX13株与2019-2022年4个分离株的相似性较高,在95.3%~96.3%之间;BX13株和4个分离株均属于DK-HK-Y280-97所在亚群的分支;新流腺三联灭活疫苗免疫后,各免疫组鸡H9亚型AIV HI抗体效价明显上升,达到9.2~9.9 log2,而对照组鸡抗体为阴性;用同源BX13株攻毒后,对照组鸡100%(5/5)阳性,免疫组鸡100%(10/10)阴性,保护率为100%;用4株H9亚型AIV分离株攻毒后,对照组鸡100%(5/5)阳性,免疫组鸡90%(9/10)~100%(10/10)阴性,保护率为90%~100%。【结论】以BX13株制备出的新流腺三联灭活疫苗对目前的流行毒株具有较好的免疫保护效果。

囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响

为研究囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响,将200只鸡分为疫苗组、疫苗+囊素组、囊素组和对照组,每组50只。从13日龄起每7 d测定其法氏囊指数、禽流感(H9)HI抗体水平。结果表明:囊素肽能提高禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫后的抗体水平,并延长高水平抗体的维持期,能显著地促进法氏囊的生长发育。

禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗不同剂量的免疫效果比较

将 4 7只 2 8日龄SPF鸡分为 4组 ,第 1～ 3组为试验组 ,每组 12只 ,分别肌肉注射禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗 0 .1、0 .3、0 .5mL/只 ,第 4组 11只为对照组。各组鸡在免疫后 1、2、3周采血 ,测定H9抗体水平 ;在免疫后 3周用 1∶10稀释的AIV H9N2攻毒 ,0 .2mL/只。攻毒后第2、3、4周继续测定H9抗体水平 ,观察了疫苗对鸡的保护效果。结果显示 ,0 .5mL/只剂量的免疫效果比 0 .1mL/只和 0 .3mL/只剂量的免疫效果好 ;攻毒用的AIV H9N2的致病力低 ,对所有试验鸡均不致死。

禽流感H_5亚型油乳剂灭活疫苗抗体消长规律的研究

用禽流感H5N2 亚型毒株接种 10日龄SPF鸡胚 ,收获尿囊液 ,经甲醛灭活后与优质矿物油佐剂混合乳化制成油乳剂灭活疫苗。抽取其中三批 ,接种 2 8日龄非免疫鸡 10 0羽 ,4天后检测抗体 ,以后每隔 1周或 2周采血检测H5亚型HI抗体 ,并于抗体水平为 2log2、4log2、6log2左右时攻毒。结果表明 ,免疫后 4天即能检测出抗体 ,之后逐渐上升 ,至第 5周抗体水平达到高峰且较稳定 ,然后缓慢下降 ,110天后抗体降至临界值以下。攻毒结果表明 ,能使鸡抵抗强毒攻击的抗体临界值为 6log2。

禽流感H5、H9亚型灭活油乳剂疫苗的免疫效果评价

对采自成都市牧星蛋鸡场免疫鸡群的2 943份血清样品进行了H5、H9亚型禽流感抗体免疫接种试验。结果表明,在2 943份血清样品中,H5、H9亚型HI效价≥4 log 2的样品数量分别为2 455、2 738份,免疫合格率分别为83.4%、93.1%,免疫后抗体高峰维持7log2以上的时间达63 d以上。超过蛋鸡场免疫合格标准,可大面积用于禽流感强制免疫和防控。

禽流感病毒H9亚型灭活油乳剂疫苗的免疫试验

以低致病性禽流感病毒 (AIV)H9N2亚型株的鸡胚适应毒经尿囊腔接种 1 0日龄鸡胚 ,从2 4h后死亡胚及 96h后 4℃致冷死亡胚收集尿囊液。尿囊液的血凝价约 7log2 ,每毫升约含 1 0 8 6个ELD50 的病毒。将尿囊液经 0 1 %福马林灭活后 ,用超滤器将尿囊液浓缩 5倍后分别制成双联灭活疫苗。对 4周龄SPF鸡肌肉注射 0 5ml或 0 3ml单联H9亚型AIV灭活苗 ,在接种后 2、3、4、5周后 ,血清中对H9亚型AIV的血凝抑制 (HI)抗体效价分别是 5 1、7 2、8 3、1 0log2 或 3 8、6 5、6 3、8 3log2 。注射 0 5ml的H9亚型AIV和NDV二联油乳苗的鸡 ,在接种后 2、3、4、5周对H9亚型AIV及Lasota株NDV的HI滴度分别是 4 6、5 6、6 7、8log2 及 7、7 6、6 7、7log2 。显然 。

H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选

为筛选出具有良好免疫原性的禽流感病毒(AIV)H9N2亚型灭活流行株种毒,选择2008年中国大陆8个省份15株H9N2亚型AIV分离株进行抗原性分析,选取代表流行株进行鉴定并制备灭活疫苗,进行免疫效力评估。实验结果显示,2008年分离株之间抗原性比较接近,与2000年前分离株的抗原性相差较大;2008年分离的8株病毒HA基因核苷酸同源率在93.2%～98.6%之间,而CK/SH/10/01毒株与这8株病毒的同源率仅在91.9%～93.5%之间;CK/ZJ/17/08、CK/SD/2CZ/08、DK/FJ/560/08、CK/FJ/521/08、CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08候选株病毒在SPF鸡胚上连续传15代HA价及致病性等均未改变,SPF鸡鼻腔感染106EID50各毒株后均无任何症状和死亡出现;候选株灭活疫苗免疫SPF鸡3周时,产生针对疫苗株抗原检测的HI抗体介于10.35log2～11.811log2,以106EID50剂量鼻腔感染途径攻毒后,只有CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08株灭活疫苗免疫鸡不仅可以对同源毒株的攻击提供良好的免疫保护,而且对2008年分离的异源毒株的攻击也能提供比较理想的免疫保护,可作为适合我国大部分地区应用的H9N2亚型禽流感灭活疫苗种毒株。

鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对雏鸡的免疫效力研究

为了评估鸡新城疫(ND)-传染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI)(H9亚型)三联灭活疫苗对雏鸡的免疫效力,采用该疫苗分别免疫1、7、10、14、21日龄SPF雏鸡和带有母源抗体的普通雏鸡,免疫后21d^28d采血测定ND血凝抑制抗体(HIAb)、IBD中和抗体(NA)及AI(H9)HIAb抗体,并用传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒攻击。结果显示,免疫后各不同日龄免疫组SPF雏鸡的ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb滴度分别为7.9log2~8.3log2、13.9log2~15.8log2及8.0log2~8.9log2,IBDV攻毒均100%保护;而普通雏鸡免疫后的ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb滴度,1日龄免疫组分别为5.9log2、12.1log2和5.6log2,7、10、14、21日龄免疫组分别为6.1log2~7.0log2、12.6log2~14.5log2和6.0log2~7.5log2;IBDV攻毒,1日龄免疫组普通雏鸡保护率为60%,7、14及21日龄免疫组保护率均为100%;结果证实,SPF雏鸡所产生的免疫效力要高于带有母源抗体的普通雏鸡,1日龄普通雏鸡免疫所产生的免疫效力明显低于其他日龄。根据试验结果,推荐该疫苗对雏鸡的使用日龄为7日龄~14日龄。

H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫、免疫后攻毒及人工感染鸡抗体的监测

本研究采用ＡＧＰ、ＨＩ等试验方法，对经Ｈ９亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫、免疫后攻毒以及经Ｈ９Ｎ２活毒人工感染后的ＳＰＦ鸡抗体产生、消长规律进行了测定，结果表明人工感染ＳＰＦ鸡和免疫鸡一周后，ＡＧＰ的检出率即可达到１００％；Ｈ９亚型禽流感油乳剂灭活苗自免疫后一周内即可产生ＨＩ抗体，２１－２８天达到高峰，并能对相同亚型病毒感染引发良好的免疫反应。

鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的研究

为研制鸡新城疫(ND)-传染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI,H9亚型)三联灭活疫苗,用新城疫病毒(NDV)La Sota株及H9亚型禽流感病毒(AIV)WD株分别接种易感鸡胚培养,用传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJQ902株接种DF-1细胞培养,收获病毒液,经超滤浓缩、甲醛灭活后,加入油佐剂乳化制成3批疫苗。对3批制品进行了检验,其性状检验、装量检查、无菌检验、甲醛、汞类防腐剂残留量测定均符合要求,鸡对疫苗无任何不良反应。效力检验结果显示:ND部分以20μL/只剂量免疫,血凝抑制(HI)效价达5.6~6.1 log_2,攻毒后均能提供100%保护;IBD部分以0.5 mL/只剂量免疫,中和抗体效价达16.0~16.4 log_2,攻毒后均能提供100%保护;AI(H9亚型)部分以0.3 mL/只剂量免疫,HI效价达8.7~9.0 log_2,攻毒后均能提供100%保护。试验结果证实,研制的疫苗安全、免疫效力高。