H9亚型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保护试验

采用1998-2009年在河北、河南及山东分离的3株禽流感H9亚型流行毒株,分别制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,免疫后21d,采血测定HI抗体,然后用从上述3个地区及北京分离的共5株禽流感H9亚型流行毒株进行攻击,观察不同时期及地点分离的H9亚型流行毒株的交叉免疫攻毒保护效果。结果显示,用不同时期及地点的3个分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后,各免疫组试验鸡H9亚型禽流感的HI抗体效价均明显上升,不同毒株灭活疫苗所诱导产生的HI抗体效价存在着不同程度的差异,用同源毒株作为抗原测定免疫组鸡的血清样品,可获得较高的HI抗体效价。攻毒试验结果证明,对不同时期及地点分离的禽流感H9亚型流行毒株间产生了较好的交叉保护力。用1998年分离的WD98株制备出的灭活疫苗对目前的流行毒株仍具有较好的保护效力。

禽流感病毒(H9亚型)流行性毒株的分离、筛选与鉴定

为了明确2023年我国禽流感病毒H9N2亚型的流行情况,从北京、河北、河南、山东、山西、福建、四川、广西、辽宁等地养殖场送检的50份病料进行病毒分离鉴定,共分离到19株具有血凝性的培养物,对19个具有血凝性的培养物开展了血清学试验和RT-PCR试验初步鉴定,其中8株鉴定为H9N2亚型禽流感病毒,接下来对8株H9N2亚型禽流感病毒进行了HA基因测序与遗传进化分析,同时使用8株H9N2分离株以及目前普遍使用的H9亚型禽流感灭活疫苗的疫苗株制备灭活疫苗免疫SPF鸡制备高免血清,开展交叉血凝抑制试验,筛选出血清保护谱广的分离株BJ23株,然后使用BJ23株在SPF鸡中开展免疫攻毒保护研究。结果表明,分离株与我国目前普遍使用的H9亚型禽流感灭活疫苗株之间存在着一定的遗传距离,HA基因的核苷酸同源性为87.5%~93.1%,8株H9N2分离株同属于Y280种系;BJ23株对近年来分离的H9N2禽流感毒株交叉血凝保护谱广;使用BJ23株制备的灭活疫苗免疫SPF鸡后21日,使用8株分离株以及目前普遍使用的疫苗株WJ57株进行免疫后攻毒试验,BJ23株制备的疫苗不仅可以抵御同源毒株的攻击,而且对异源毒株的攻击也可提供理想的保护。结果表明,BJ23株适合作为疫苗候选株进行进一步研究。

禽流感H9亚型流行毒株交叉免疫保护试验

采用北京市农林科学院畜牧兽医研究所1998年-2008年在北京及河北省分离的4株禽流感病毒H9亚型流行毒株,分别制备不同分离毒株灭活疫苗,免疫SPF鸡,进行交叉免疫保护试验。结果表明,用4个不同时期的分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后,各免疫组鸡禽流感(H9亚型)的HI抗体效价均明显上升,所诱导产生的HI抗体效价基本相同;不同时期分离毒株大多产生了较好的交叉保护力。用1998年、2004年及2006年分离的流行毒株制备出的灭活疫苗能够保护2008年流行毒株的攻击。

6株H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异分析

H9N2亚型禽流感持续在我国鸡群中广泛流行,为了明确2017年山东省聊城市一肉鸡场H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异情况,对6株H9N2亚型病毒分离株进行了基因扩增、序列测定和进化分析,并分别使用病毒分离株和疫苗株抗原进行血凝抑制试验,比较免疫鸡血清的抗体效价差异。结果如下:NCBI Blastn分析表明,与各分离株基因同源性最高的序列分别来源于山东、河北、上海、江苏、浙江、江西、湖南、广东和日本等地的分离株,表明H9N2亚型禽流感病毒传播范围广,基因重排活跃。各基因的系统进化分析表明,分离株的8个基因片段分别与禽流感病毒欧亚分支的A/duck/HongKong/Y280亚系、A/quail/HongKong/G1/97亚系以及A/chicken/Shanghai/F/98亚系进化关系密切。从病毒基因型上来分析,6株病毒均隶属于2010年以来在国内鸡群中广泛流行的G57基因型。与耐药性相关的氨基酸位点分析表明,病毒M2蛋白存在S31N变异,表明病毒对离子通道蛋白抑制剂耐药。对1 000份疫苗免疫鸡血清进行血凝抑制抗体效价的检测,发现H9N2亚型禽流感分离株抗原与疫苗用标准抗原相比,所测得的血凝抑制抗体滴度平均低1~2log2,表明二者HA抗原性略有差异。总之,2017年在该肉鸡场流行的这6株H9N2亚型禽流感病毒仍然为G57基因型,分离株的HA抗原反应性与疫苗株略有差异。

H9亚型禽流感病毒分离株A/Chick/Shandong/6/96的基因序列分析

对 1株H9N 2亚型禽流感病毒 (AIV)A/Chick/Shandong/ 6/ 96(H9N2 )进行了全病毒基因序列分析。结果表明 ,该毒株 8个基因的核苷酸序列皆与 1994年分离株A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H9N2 )具有很高的同源性 (96.0 %—98.6% ) ;推导其血凝素 (HA)裂解位点处的氨基酸序列为A R S S R ,完全符合H9AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/ 1/ 94亚分支的特征 ;虽然其神经氨酸酶 (NA)基因与A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H 9N2 )相比 ,出现了 9个核苷酸的缺失 ,然而其同源性仍然较高 ,为 97.3 % ;而与欧亚分支中的类A/Chicken/Korea/ 3 2 3 / 96和类A/Quail/HongKong/G1/ 97亚分支的同源性却相对较低 ,分别为 92 .0 %和 84.2 % ;其它基因的比较情况也大体相近。提示该毒株是由 1994年分离株进化而来 ,在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H9N2 )亚分支。

鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对H9亚型禽流感流行毒株的保护效果

为了检验鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对H9亚型禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果,将鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗免疫接种21日龄SPF鸡,免疫接种后3周采血测定AI(H9)HI抗体,并用2004年—2012年分离的8株H9亚型禽流感病毒对免疫接种鸡进行攻毒试验。结果显示,试验鸡免疫接种三联灭活苗后21d,其H9 HI抗体效价可达11.88log2,可抵抗8个不同H9亚型禽流感流行毒株的攻击,总攻毒保护率达92.50%(37/40)。鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗中H9亚型禽流感毒株具有良好的免疫原性,能抵抗不同年代不同地区分离的H9亚型禽流感流行毒株的攻击。

H9N2亚型禽流感病毒株的分离和鉴定

用非免疫鸡胚从病死鸡的脑组织中分离到禽流感病毒。此病毒能凝集鸡红细胞,而且这种凝集可以被特异性抗血清所抑制。通过对分离株进行血清学试验、最小致死量致死鸡胚平均死亡时间测定、鸡致病力试验、回归试验,证明该分离株为H9N2亚型禽流感病毒。

H9N2亚型禽流感病毒TJ_1株的分离与鉴定

从发病蛋鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒TJ1株,对其进行了系统的生物学特性鉴定。结果表明,分离毒TJ1株具有血凝性,且凝集不被新城疫和产蛋下降综合征抗血清抑制,而被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清抑制,禽流感琼扩试验结果为阳性,在电镜下呈典型的流感病毒粒子形态,证明该毒株为A型流感病毒;通过致病力试验,分离毒TJ1株对6周龄SPF鸡无致病性,为低致病性毒株;用其制备成油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡,能很快产生对H9特异的血凝抑制抗体,于免疫后3周攻毒,可以保护雏鸡抵御同病毒攻击的感染,表明分离毒TJ1株具有良好的免疫原性。

H9N2亚型禽流感病毒上海分离株生物学特性鉴定

本研究采用HA试验、HI试验、EID50试验及抗原差异R值的测定比较分析了上海地区2002-2008年间分离的7株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的抗原性，探讨H9N2亚型AIV上海分离株的抗原性变化和进化关系，为流感疫苗株的合理选择、流感疫情的扑灭提供理论上的指导。

禽流感H11N9亚型病毒东方白鹳分离株的基因特征

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成12对特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别成功扩增出分离于东方白鹳(Ciconia boyciana)的1株H11N9亚型禽流感病毒的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树。结果表明:所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为2280、2274、2151、1692、1497、1413、759、838bp核苷酸,分别编码759、757、716、563、498、470、252/97、230/121个氨基酸。该毒株HA有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点序列为PAIASR↓GLFG,无连续的多个碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。根据该毒株与参考毒株的序列比较分析结果推测,该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过互相基因交换所形成的基因重组体。

H9亚型禽流感、传染性喉气管炎及水禽黄病毒病流行动态与防控

1H9亚型禽流感 1.1疫病概况 从2008年11月份开始,该病几乎每年冬天均会发生,但2010-2011年度最为严重,表现为反复发生。主要表现为支气管有黄色干酪样栓子堵塞,发病鸡呼吸困难,窒息死亡。该病主要发生在日龄较小的鸡,一般在12-29日龄,平均25日龄,发病率100%,死亡高峰为发病后的3-10d,死亡率一般在15%-40%之间,最高为80.59%,平均21.73%。

H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

为评价H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护效果,将禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只接种21日龄SPF鸡,3周后采血测定HI抗体效价,并用2018年-2019年分离的4株H9亚型禽流感病毒分别进行攻毒。结果显示,免疫后21 d,HF株灭活疫苗免疫组HI抗体效价达到9.1 log2以上,商品化疫苗HI抗体效价几何平均值则为6.3 log2以内。4株H9亚型禽流感病毒流行毒株以10^(7.0)EID_(50)的剂量静脉攻毒后,HF株灭活疫苗免疫组可抵抗流行毒株的攻击,保护率为100%;而商品化疫苗对流行毒株的攻毒保护率仅为40%~60%。说明H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗具有较强的免疫原性,能使免疫鸡抵抗流行毒株的攻击。

我国H9亚型禽流感病毒部分流行株的抗原性差异分析

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在，该病毒在我国首次由陈伯伦等在1994年从广东省的发病鸡群中分离得到，在随后的几年内，该病毒迅速传播到了我国大部分养禽地区，并呈现出地区流行的特点，持续存在。H9N2亚型的禽流感病毒虽然致死率低，但可引起蛋鸡的产蛋率显著下降，并且在肉鸡和青年鸡中易与其它病原体合并感染，引起死淘率升高，因此该病给我国的养禽业，尤其是养鸡业造成了巨大的损失。

关于低致病性H9亚型禽流感病毒株的致病性及免疫原性的研究

以低致病性禽流感病毒 (AIV)H9亚型毒株第 1 7代种毒按 1 1 0稀释攻毒 60日龄SPF蛋用公鸡 ,无一死亡。 1 0d后采集血清 ,再分别对其进行免疫接种 ,并在免疫后每隔 1 5d或 30d测定血清中抗体水平 ,发现该种H9疫苗对攻毒后的SPF鸡免疫能够达到比较高的抗体水平 ,攻毒后 2个月时产生的抗体水平最高 ,以后逐渐下降 ,但在免疫后 80d仍然保持较高的抗体水平。表明该毒株为低致病性毒株 。

禽流感病毒(H9亚型)LN株的分离鉴定及生物学特性研究

禽流行性感冒(简称禽流感，AvainInfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类(包括家禽和野禽)的感染疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病，被世界动物卫生组织确立为A类传染病。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。

H9N2亚型禽流感流行分析及疫苗毒株的筛选

本研究旨在筛选新型免疫原性好、广谱的优秀H9亚型禽流感病毒疫苗株。通过H9N2分子流行病学调查对分离得到的37株禽流感H9N2亚型病毒进行HA基因分子遗传进化及其关键位点分析,利用交叉HI效价及鸡胚中和试验分析毒株间毒力及其相关性,制备疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,从37株病毒中选出12株病毒作为代表,分为3个分支,同分支之间交叉HI效价及中和效价最高。HI试验及鸡胚中和试验均显示同分支毒株间的相关系数高。免疫攻毒保护试验显示同分支疫苗株安全性高。表明我国禽流感H9N2亚型情况复杂,且疫苗保护效果与疫苗株的抗原匹配性密切相关,生产多种分支H9疫苗株联合更有利于控制H9型禽流感,

H9亚型禽流感病毒广西株的分离与鉴定

2010年5月，广西某肉鸡养殖场免疫传染性支气管炎、禽流感、新城疫疫苗的8500只黄羽肉鸡自22日龄开始出现死亡，5d内陆续死亡500多只，剖检发现支气管黏膜严重出血、支气管堵塞，充满淡黄色干酪样物质，肾脏肿大、有暗红色充血性坏死灶，初步怀疑为禽流感和新城疫病毒感染。我们采集典型病料，进行病毒分离、RT—PCR和动物回归试验等，最终确定该病毒为H9亚型禽流感病毒。

全国部分地区H9亚型禽流感病毒分子流行病学和遗传变异分析

旨在了解2020—2021年间全国部分地区H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)的分子流行病学和遗传变异情况,因此从全国部分地区采集到10336份临床样本进行了H9-AIV包括核酸检测、病毒分离、HA基因测序和遗传变异等方面的分析。病原核酸检测结果显示,AIV-H9阳性率为16.1%(1665/10336),白羽肉鸡中的检出率最高,商品肉鸡检出率高于蛋鸡。本研究获得920株H9-AIV分离株,其中464个代表性毒株的遗传进化分析显示,所有分离株全部位于h9.2.4.5分支,且均为典型低致病性AIV,与WJ57毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为92.2%~99.9%和89.6%~99.8%;结合关键氨基酸位点分析,这些分离株逐步向哺乳动物适应性和气溶胶传播方向发生变异。以上数据表明,H9-AIV分离株进一步增强了对哺乳动物的感染力且传播力不断加强,因此持续监控其检出和变异对家禽健康养殖、人类健康至关重要。

H9N2亚型禽流感病毒传播途径特性的比较及其表面基因序列分析

选择中国大陆最早分离的H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）A／Chicken／Guangdong／SS／94（H9N2）（缩写为SS株）和1998年大流行时期分离的H9N2亚型AIV A／Chicken／Shanghai／F／98（H9N2）（缩写为F株）为研究对象，对其在SPF鸡体内的复制能力和传播途径特性比较后发现，F株在4周龄SPF鸡气管中的复制能力高于SS株，F株可以经气溶腔传播途径传播。SS株不能经气溶腔传播途径传播；利用反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法获取F株和SS株的HA和NA基因的cDNA，序列分析得知，F株和SS株的HA和NA基因的同源性分别是96．6％和98．1％；HA基因的裂解位点氨基酸序列都是PARSSR↓GL。但有5个氨基酸的盖异，即166位N（F）→D（SS）、198位A（F）→V（SS）、217位V（F）→I（SS）、335位G（F）→R（SS）、504位L（F）→S（SS）；2株病毒的NA基因在63～65住都存在氨基酸缺失，但在NA基因红细胞吸附位点的氨基酸序列不同，分别是IKKD—SRSG（F）和IKEDLRSG（SS）。F株和SS株的传播特性差异是否与其表面基因序列有关，有待进一步研究。