抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

用基因疫苗pcDNA-H9、纯化H9N2亚型AIV和重组噬菌体T4-H9HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6)、H9-02(3B1)、H9-03(3H11)、H9-04(1A4)、H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01、H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。为进一步分析H9N2亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。

宁夏部分地区H9亚型禽流感病毒HA基因演化分析

为了解宁夏地区H9亚型禽流感病毒的流行情况与分子遗传学特征,2022年4—6月在宁夏养禽业集中的6个县(市、区)共采集1 240份咽喉/泄殖腔拭子,采用实时荧光定量PCR进行AIV核酸检测,并对RT-PCR扩增的HA基因阳性产物进行测序分析及生物信息学分析。结果表明,参试样本中总AIV阳性率为9.84%,其中H9亚型阳性率为7.59%;HA蛋白裂解位点分析发现氨基酸序列均为PSRSSR的非连续性碱性氨基酸的插入,符合低致病性禽流感特征,且均发生Q234L突变(H9编码),具有与人流感受体唾液酸α-2,6-受体结合的特性;生物信息学分析显示H9亚型AIV毒力和致病力等生物学特性有趋于转强的可能性,经过基因重排可能会进化出新的禽流感亚型或分支。因此,在禽类养殖过程中,必须对H9亚型AIV加以重视并加强预警,严格做好监测防控工作。

H9N2亚型AIV全基因序列分析及重组病毒R01/NASS气源性传播的特点

为了研究H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)气源性传播的分子机制,本研究以1株2008年山东省分离的H9N2亚型AIV为研究对象,对其全基因组序列进行分子特性和遗传进化分析;利用反向遗传操作技术,对具有气源性传染能力的山东分离株(SD01株)和不具有气源性传染能力的广东分离株(SS94株)进行重组,转染细胞拯救出重组株R01/NASS,对其在鸡群间的气源性传染能力进行测定。对SD01株序列分析表明,SD01株的M、NS、NP和HA基因与HK/G9/97相似性最高,NA、PB1和PB2基因与HK/Y280/97相似性最高,PA基因与SH/F/98相似性最高。病毒在SPF鸡群间传播性试验发现,重组病毒R01/NASS接种鸡群后,可以经直接接触途径传染鸡群,但是却未感染气溶胶被动感染组鸡群,表明NA基因的替换使病毒失去了气源性传染的能力。该试验结果为从分子水平上深入研究SD01株AIV NA蛋白氨基酸位点与气源性传染的关系提供了理论依据。

不同接种途径对H9亚型禽流感病毒在SPF鸡的致病性

目的探讨H9亚型AIV不同接种途径对SPF鸡致病性的影响。方法以气管接种和静脉接种途径对SPF鸡进行人工感染。结果气管接种组死亡率为16.7%,而静脉接种组未见死亡;称重发现气管接种组平均体重显著低于静脉接种组;跟踪泄殖腔排毒发现气管接种组试验鸡排毒率高于静脉接种组,排毒时间也长于后者;病理切片观察可见气管接种组病变严重,恢复期长;在免疫组化试验中,气管接种组可在肺中检测到病毒存在,而静脉接种组各组织中均未检测到病毒的存在。结论气管接种H9亚型AIV组比静脉接种组致病性更强,是评价H9亚型AIV致病性更为有效的接种途径。

波形蛋白对H9N2亚型AIV复制的影响研究

为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋白表达显著被抑制。荧光定量PCR结果亦证实病毒HA基因在AIV感染后36 h时表达水平明显降低。上述结果表明,H9N2亚型AIV在人源Hela细胞上的早期复制中,vimentin能起到一定程度上的抑制作用,且其重组表达蛋白孵育细胞能够阻断H9N2亚型AIV对细胞的感染,为深入研究vimentin抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗H9N2亚型AIV的药物研发提供了参考。

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。

广西边境地区家禽H9亚型流感病毒调查

为了解中越边境地区H9亚型禽流感病毒(AIV)的流行情况,本研究收集2012年12月～2015年12月广西边境地区主要活禽市场和养殖场的家禽拭子及环境样品,采用病原分离和鉴定方法对样品进行了分析。结果显示,H9亚型AIV整体分离率为3.01%,其中冬春季节(3.47%)高于夏秋两季(1.39%);市场样品的病毒分离率(3.73%)高于养殖场(1.53%);在鸡、鸭、鹅源样品中均能检测到H9亚型AIV,其中鸡源样品的H9亚型AIV分离率最高(7.68%),鹅次之(1.43%)。本研究表明,H9亚型AIV在广西边境地区表现出一定的时间、空间和群间分布特征。本研究对H9亚型AIV进行跟踪监测可为预防和控制禽流感提供重要的流行病学信息。

金丝桃素蛋白络合物在鸡体内对H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果的研究

为了明确金丝桃素蛋白络合物在动物体内对H9N2亚型AIV的杀灭效果及临床上用于预防和治疗的剂量,将180只28日龄非免疫石歧杂黄鸡随机分为6组,分别为金丝桃素蛋白络合物高、中、低剂量组,金刚烷胺药物对照组,感染不给药组及健康对照组。其中,金丝桃素蛋白络合物三个剂量组的实验鸡于感染H9N2亚型AIV12h后分别以不同的剂量灌服给药,而金刚烷胺药物组于攻毒12h后以100mg/l饮水。用棉拭子采集各实验组鸡的咽喉及泄殖腔黏液,进行微量血凝(HA)试验及RT-PCR检测,以确定各实验组鸡的排毒情况。结果表明,金丝桃素蛋白络合物对人工感染H9N2亚型AIV的实验鸡有较好的保护作用,与金刚烷胺药物对照及感染不给药组相比有显著差异。

H9N2亚型禽流感病毒SD18株的传染性及不同途径感染效果比较

【目的】研究H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)对哺乳动物的传染性和致病性。【方法】采集样品进行病毒的分离鉴定,将分离到的病毒以300μL/只(10^(7) EID_(50))的剂量通过滴鼻和肺递送方式感染豚鼠,每组各15只,对2组感染效果进行比较,然后通过分离株在豚鼠中的传播能力试验验证其气溶胶传播能力,通过间接免疫荧光试验检测分离株在人支气管上皮细胞上的复制能力。【结果】试验分离到1株H9N2亚型AIV,命名为SD18,病毒通过肺递送和滴鼻2种攻毒方式感染豚鼠后,肺递送组的排毒量显著高于滴鼻组(P<0.05)。通过对豚鼠肺脏相关模式识别受体和抗病毒蛋白的表达检测发现,2种攻毒方式都能诱导相关的免疫因子Toll样受体3(TLR3)、TLR7、抗黏病毒蛋白(MX)和2′,5′-腺苷酸激酶(OAS)表达量极显著上调(P<0.01);2组在攻毒后第6天产生抗体,并呈上升趋势。对SD18株在豚鼠中的传播能力验证发现,SD18株具有通过直接接触和飞沫传播感染豚鼠的能力,但并未证实气溶胶的产生和传播。对SD18株感染人支气管上皮细胞BEAS-2B后发现,在感染后12 h可检测到病毒,24 h时病毒在细胞内复制能力最强,TLR3、TLR7、MX、OAS、白介素6(IL-6)、IL-8、干扰素-β(IFN-β)相关的免疫因子表达量极显著上调(P<0.01)。【结论】H9N2亚型AIV SD18株的跨种传播能力变强,具有不经提前适应便可直接感染豚鼠的能力;SD18株具有通过飞沫传播感染豚鼠并使其产生抗体的能力且SD18株可在人支气管上皮细胞BEAS-2B上进行复制。

海藻硫酸多糖和中药复方对鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒的作用

为探讨海藻硫酸多糖(sulfated polysaccharide from algae,SPA)及中药复方提取液(compound extracts of Chinese medicine,CECM)对H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的作用,将SPA及CECM以3种不同加药方式作用于接种了H9N2亚型AIV的10日龄SPF鸡胚中,无菌收集鸡胚尿囊液,测定血凝效价,检测2种药液对H9N2亚型AIV的预防、治疗及直接灭活作用。结果显示,SPA及CECM的最大安全浓度分别为50和200mg/mL;3种不同加药方式下,不同浓度SPA及CECM均能极显著降低鸡胚尿囊液中H9N2亚型AIV的血凝效价(P<0.01),以直接灭活作用组的血凝效价降低幅度最大,预防作用组和治疗作用组次之。预防作用组,CECM高剂量组(200mg/mL)的抗病毒效果显著优于SPA各剂量组(12.5、25和50mg/mL)及CECM低、中剂量组(50和100 mg/mL)(P<0.05);治疗作用组,SPA高剂量组(50 mg/mL)及CECM中、高剂量组(100和200mg/mL)抗病毒效果显著优于SPA低剂量组(12.5mg/mL)(P<0.05);直接灭活作用组,SPA及CECM的抗病毒效果均佳,CECM各剂量组的抗病毒效果与SPA各剂量组差异极显著(P<0.01)。结果表明,SPA和CECM对10日龄鸡胚几乎无毒副作用;SPA及CECM均能显著抑制H9N2亚型AIV在鸡胚尿囊液中的增殖,以直接灭活作用组的抗病毒效果最佳,其抗H9N2亚型AIV作用的强弱与药物浓度、用药和病毒的感染时间顺序密切相关。

H9亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位的预测

试验运用Clustalx 1.8进行多序列比对,运用Kolaskar&Tongaonkar antigenicity和Bepipred linear Epitope Prediction算法对模板毒株HA蛋白的线性抗原表位进行预测。综合参数预测结果得到4个抗原表位,分别是位于HA蛋白的第26-39aa、166-179aa、225-238aa和490-499aa,为H9-AIV表位疫苗的研制提供参考。

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚。选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点;利用单抗对2017—2019年H9N2亚型AIV代表株进行HI抗原谱分析,确定抗原位点与基因分型关系;分析我国H9N2亚型AIV相应抗原位点的变异规律。结果显示:单抗2E4与2D6分别识别HA头部的145位和153位抗原位点;2017—2019年华东地区H9N2亚型AIV分离株根据HA基因遗传进化树可分为Group 1和Group 2两大分支,Group 1代表株与两株单抗反应性好,而Group 2代表株与两株单抗反应性差,序列分析发现已发生S145D(16/16)和D153G(15/16)的突变;通过对我国1996—2021年禽源H9N2亚型AIV HA蛋白位点自然突变率分析发现,含HA蛋白145D和153G的毒株占比分别上升至68%和66%,成为优势流行株。单抗2E4可用于当前H9N2亚型AIV的抗原分型,抗原位点145位是鉴别Group 1和Group 2抗原群差异的分子靶标之一。

H9N2亚型禽流感病毒流行病学研究进展

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在我国已有二十多年的流行历史,且在我国鸡群中广泛传播,给家禽养殖业造成了巨额损失;H9N2亚型AIV感染人事件的报道也屡见不鲜,给公共卫生带来了巨大的压力和挑战。为了有效控制H9N2亚型AIV的流行和传播,降低其感染风险,文章从流行特点、分子适应机制、感染宿主范围以及防控措施等方面对H9N2亚型AIV的流行病学进行了系统阐述,在阐明H9N2亚型AIV的流行规律及趋势的同时,概述了其分子致病机制,并初步评估了其进化方向和风险性,为AIV的综合防控提供参考依据和理论支持。

利用8质粒系统拯救A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒

应用反向遗传技术将含有1998年中国大陆分离株H9N2亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)的8个基因片段的质粒共转染COS_1细胞,产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV。将A Chicken Shanghai F 98(CK SH F 98)株H9N2亚型AIV的8个基因组cDNA分别克隆到polⅠ_polⅡ转录 表达载体pHW2 0 0 0中,构建成8个转录表达载体重组质粒。将这8个质粒共转染COS_1细胞,2 4h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,4 8h后收取鸡胚尿囊液继续进行鸡胚传代,产生能致死鸡胚的病毒。经血凝、血凝抑制试验、序列分析和电镜观察,证实产生了CK SH F 98(H9N2 )株AIV。

H9N2亚型AIV HA蛋白第226位点氨基酸多样性分析及3株病毒受体结合能力检测

目的了解目前我国家禽业中流行的H9N2亚型AIV的HA蛋白第226位氨基酸残基的多样性,并用固相糖链ELISA方法检测实验室保存的3株H9N2亚型AIV病毒的受体结合能力。方法从NCBI数据库中下载我国分离的H9N2流感病毒的HA氨基酸序列,对其第226位(参照H3亚型HA位点)氨基酸残基的种类进行统计分析,并利用固相糖链ELISA方法对3株H9N2亚型AIV的受体结合能力进行检测。结果与H9N2流感病毒受体结合能力相关的HA226位点已呈现出多样性,分别为HAL226、HAQ226、HAM226和HAF226,其占有比率分别为81.85%、17.57%、4.81%和0.11%;进一步统计分析表明,我国近几年分离的H9N2流感病毒以HAL226为主。受体结合能力检测显示,CK/JN/3(HAL226)只具有结合人样受体的能力,CK/JL/06(HAQ226)只具有结合禽样受体的能力,而CK/JN/2(HAF226)则具有双受体结合特性,其中与人样受体结合能力稍高。结论当前我国家禽中流行的H9N2亚型AIV中以具有HAL226位点特征的毒株占优势,而这一位点特征与病毒结合人样受体有关。因此,H9N2亚型AIV具有突破种间屏障并引发新的流感大流行的潜在威胁。

1例蛋鸡混合感染的病原检测与分析

为明确盐城某规模化养殖场蛋鸡死亡原因,针对2022年冬季送检的17只患病蛋鸡进行了病理剖检、细菌分离鉴定和常规PCR检测。细菌分离鉴定结果表明分离到1株致病性大肠杆菌;PCR检测结果包括H9亚型AIV 1份、CAV 4份、MDV和CAV混感1份、FAdV和CAV混感1份、H9和CAV混感6份。结合临床症状、病理变化和实验室检测结果,该次疫情诊断为CAV、H9亚型AIV、FAdV、MDV和EC混合感染。

重组禽流感病毒(H_5N_2)的拯救及其生物学特性分析

为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感（Avian influenza virus，AIV）和筛选具有标记的疫苗毒株，用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV（A／PR／8／34毒株）的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2／PR8株。

适应H_9亚型禽流感病毒增殖的重组R-MDCK细胞系的建立

克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒p IRES中,构建重组质粒p IRES-ST3GalⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞,用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H_9亚型禽流感病毒毒株按相同滴度接种R-MDCK细胞和空白MDCK细胞,通过HA试验和TCID_(50)试验,检测不同H_9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞上的增殖效果。结果发现,所有H_9亚型禽流感病毒毒株在RMDCK细胞HA和TCID_(50)结果均显著高于空白MDCK细胞。ST3GalⅠ基因在第12代R-MDCK细胞中仍能稳定表达,R-MDCK细胞可显著提升H_9亚型低致病性禽流感病毒培养的滴度,可以替代鸡胚用于H_9亚型低致病性禽流感病毒的生产。

H9N2亚型禽流感病毒新疆油鸡分离株NS基因序列测定及进化生物信息分析

为了明确新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒(AIV)非结构蛋白基因NS的遗传进化情况,本研究采用RT-PCR方法对新疆油鸡分离株的NS基因进行了克隆和序列测定,获得NS蛋白的完整编码序列。将NS基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与GenBank中已经公布的参考序列进行同源性比较,结果表明,新疆油鸡分离株的NS基因与国内其他物种稳定存在的H9亚型AIV A/Chicken/Beijing/1/1994的NS基因处于同一分支,在系统进化上属于NS基因的A等位基因群。

2017年河北省蛋鸡养殖场H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化和抗原性分析

【背景】H9N2亚型禽流感病毒在鸡群中广泛流行,引起巨大损失。【目的】了解河北省蛋鸡养殖场H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的基因序列和抗原性的变异情况,为该病原的科学防控提供理论依据。【方法】于2017年从河北省部分蛋鸡养殖场分离鉴定出7株H9N2亚型AIV,对其HA基因进行序列测定,并进行遗传演化、关键氨基酸位点及抗原性分析。【结果】7株分离毒株HA基因同源性在95.5%-97.2%之间;与2016年前的流行毒株相比,分离病毒HA裂解位点均为典型低致病性AIV特征,在受体结合区域出现变异,潜在糖基化位点无明显差异;抗原分析结果显示分离毒株与早期分离株相比抗原性发生了变异,形成了新的抗原群;抗原性相关位点分析显示,分离毒株在9个位点发生了较为明显的突变,可能是导致抗原性变异的分子基础。【结论】河北省蛋鸡养殖场H9N2亚型AIV中的流行毒株在关键功能区发生基因突变,并且抗原性发生变异,提示应持续监测H9N2亚型AIV的遗传变异情况,并及时更换疫苗株。