H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒(AIV)四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒(AIV)的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法(NY/T 772-2013)检测结果一致,κ值为1(P<0.001)。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。

禽流感病毒H_5和H_9亚型RT-PCR检测方法的建立

根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件。该方法敏感性可达10-3,特异性好,与NFV、IBV和H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30%,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。

H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10-4 ng/μL(1.30×104 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。

检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型。方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIVRT-PCR一步法。根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性。结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点。结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析。

禽流感H_5、H_7、H_9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

禽流感病毒抗原变异性强,血清亚型多,涉及的范围广。所以,需要进一步实行保护,才能避免交叉感染。但在禽流感病毒检测时,每种检测方法每次只能检测禽流感单个亚型,耗时长。本研究的目标是采用多重实时荧光RT-PCR技术,同时检测禽流感H、H、H亚型,并研制相应的快速检测试剂盒。

H9N2亚型AIV双重RT-PCR检测方法的建立

为H9N2亚型AIV进行快速、准确鉴定与诊断,根据H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因各设计1对引物,建立了一种对2个表面基因同时进行扩增的双重RT-PCR检测方法。HA、NA基因预期扩增的目的片段长度分别为700、423 bp。通过对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10^(4.25) EID_(50)/100μL。采用该方法对H1～H15和N1～N9等亚型流感病毒及新城疫病毒等进行检测,结果只有H9N2亚型AIV出现2个特异性目的条带,与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的双重RT-PCR和病毒分离2种方法同时对送检样品进行检测,结果2种方法的符合率达99.77%,说明该检测方法特异性强、敏感性较高,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

浅析快速检测H7N9禽流感病毒的方法

随着H7N9禽流感病毒开始蔓延,一些医学者开始对H7N9禽流感病毒的检测方法进行研究,逐渐提出了RT-PCR检测方法、实时荧光RT-PCR检测方法、三重PCR检测方法、纳米荧光颗粒试纸条检测方法和NASBA检测方法等,其中,实时荧光RT-PCR检测方法是目前为止较为成熟的检测方法。该方法是根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物而建立的1种快速检测H7N9亚型禽流感病毒的方法。基于此,介绍1种快速检测H7N9亚型禽流感的方法——实时荧光RT-PCR检测方法。

水禽流感病毒分离株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)膜蛋白基因遗传进化分析

采用常规的血清学收验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行两年多的监测,分离鉴定出多株H6亚型禽流感病毒。对其中的一株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)(简称DkYZ23302)(H6N2)的表面膜蛋白基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其它序列进行了比较,遗传进化结果表明DkYZ23302的血凝素基因(HA)与近年香港分离的鸭源毒株DkHK346199(H6N1)、中国台湾鸡源毒株CkTaiwanna398的亲缘关系最近;而神经氨酸酶基因(NA)遗传进化分析结果表明DkYZ23302(H6N2)的NA基因起源于禽源H9N2亚型流感病毒,这可能是不同亚型禽流感病毒在水禽体内发生基因重配的结果。DkYZ23302(H6N2)的HA推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-D,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,与对SPF鸡的致病力试验相吻合。

多重RT-PCR快速检测禽流感病毒的研究

西北农林科技大学生物工程研究所陈思怀、湖北省农科院牧医研究所乔宪凤、华文君等6位科学工作者参考H1-H5；亚型禽流感病毒（AIV）的核蛋白（NP）基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素（HA）基因，共设计4对引物，建立了2对引物扩增AIV的NP、HA基因的多重RT-PCR方法。应用此法分别对H5、H6、H9亚型AIV尿囊液RT-PCR。电泳。回收预期片段进行测序，并同Genebank的注册序列进行同源性分析。同时还对NDV、IBV、IBDV尿囊液以及3种亚型AIV尿囊液的2倍系列稀释样品进行检测。

N9N2亚型禽流感病毒ns1基因的融合表达

华南农业大学动物科学学院陈丽、谢青梅等七位研究生和教授对H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的研究结果表明：禽流感病毒（AIV）非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在，故可通过检测NS1抗体来鉴别禽流感受病毒感染鸡群和免疫鸡群,将NS1基因和T4等菌体SOC基因在大肠埃希氏菌中融合表达，其融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原。采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的NS1基因（654bp）；

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。

H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

目的应用Taq Man探针实时荧光RT-PCR技术,建立一种快速检测H7N9禽流感病毒的方法。方法针对H7N9禽流感病毒的HA和NA基因分别设计特异性引物和Taq Man-LNA探针,建立H7N9禽流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。结果本研究建立的方法对检测H7N9禽流感病毒株的灵敏度达到10 PFU/ml。该方法特异性强,与其他亚型流感病毒株及呼吸道病原体无交叉反应。与对照方法相比,本研究方法的检测阳性符合率为99.07%,阴性符合率为100%,Kappa值为0.993。结论建立的检测试剂盒具有快速灵敏、结果准确可靠等优点,适用于H7N9禽流感病毒的分子生物学检测和监测。

H9N2亚型禽流感病毒RT-PCR鉴定方法的应用

为了对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行快速鉴定,试验根据H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因分别设计引物,初步建立H9N2亚型禽流感病毒的RT-PCR检测方法;同时为了检验该检测方法的可靠性,对送检的264份疑似禽流感病鸡的病料进行处理,接种SPF鸡胚,分别采用RTPCR和血清学试验两种方法检测收集的尿囊液。结果表明:两种方法均检出有14个样品为H9N2亚型禽流感病毒阳性,符合率达100%。说明建立的RT-PCR检测方法可用于鉴定H9N2亚型禽流感病毒。

从人分离出两株甲型流感H9N2亚型毒株内部基因特性的研究

目的 了解 2株从人分离出的H9N2亚型毒株内部基因特性 ,并弄清其来源。方法 用RT PCR扩增目的基因 ,用PGEM T Vector (美国Promega公司 ) ,4℃过夜连接 ,重组质粒转入dH5α细菌 ,筛选阳性菌落 ,酶切鉴定 ,送六合通公司自动测序。然后进行进化树分析。结果 2株测定毒株内部基因均为G9基因系 ,它们相互间除PA基因有差异外 ,其余 5个基因均相同。结论 2株测定毒株的基因组均为G9基因系 ,它们是由携带不同基因特性H9N2毒株的禽群分别直接感染人 。