灰树花多糖纳米乳的制备及其对H9亚型禽流感病毒与常见细菌抑制效果的评估

为制备灰树花多糖(GFP)纳米乳,并观察其理化及形态学特征,评估其对H9亚型禽流感病毒(AIV)及3种常见细菌的抑制效果,本研究采用低能乳化法制备GFP纳米乳,经不同方式处理后观察GFP纳米乳的稳定性,分别采用透射电镜和扫描电镜观察其形态特征,使用激光粒度仪测定GFP纳米乳的粒径与多分散系数(PDI),使用电位仪测定其Zeta电位。结果显示:该GFP纳米乳外观澄清、透明,8000 r/min离心20 min和室温静止7 d后不分层、不破乳,表明制备的GFP纳米乳性状稳定。电镜观察可见许多单一分布的均匀圆球,其周围包裹着网格状凝胶基质;GFP纳米乳的粒径为10 nm~100 nm,平均粒径24.12 nm,PDI为0.096,Zeta电位为-18.6±4.3 m V,表明GFP纳米乳稳定性较好。将不同浓度的GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂分别于MDCK细胞中与H9亚型AIV NJ02株作用,通过计算各药物对H9亚型AIV的抑制率比较GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制效果。将不同稀释度的GFP纳米乳、GFP溶液及免手洗凝胶和75%乙醇分别与AIV NJ02株作用后,采用荧光定量PCR(q PCR)检测H9亚型AIV基因的拷贝数,并计算各药物对H9亚型AIV的抑制率。采用药敏纸片法检测GFP纳米乳、GFP原液、免手洗凝胶对禽舍3种常见细菌的抑菌效果。对H9亚型AIV的抑制率检测结果显示,当浓度低于10μL/mL时,GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂对H9亚型AIV的抑制率均小于55%,效果不明显;当浓度大于40μL/mL时,GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率极显著高于同浓度的免手洗凝胶(P<0.01);当浓度为80μL/mL时,GFP纳米乳可以100%抑制病毒增殖,且对细胞无毒性。qPCR结果显示,10倍稀释的各药物对H9亚型AIV的抑制率均明显高于100倍稀释的各药物,且10倍稀释的GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率均极显著高于免手洗凝胶、GFP原液和75%乙醇(P<0.01)。纸片扩散法结果显示,GFP纳米乳对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较强,但总体GFP纳米乳的抑菌效果比免手洗凝胶稍差。上述结果表明,本研究制备的GFP纳米乳性状稳定,对体外培养的H9亚型AIV具有良好的抑制效果,对禽舍常见细菌具有一定的抑制效果,且安全无毒副作用,有望作为安全高效的纳米消毒剂用于畜禽和人类的消毒。本研究为开发新型抗病毒中草药纳米消毒剂奠定了实验基础。

一株H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株产生原因的分析

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究中,我们通过模拟H9N2禽流感免疫压力筛选出携带HA_(D201N)单点突变的逃逸株,但HA_(D201N)如何导致H9N2病毒逃逸株出现的原因尚不明确。为此,本研究利用8质粒反向遗传技术方法拯救出1株A/Chicken/Shanghai/1/2006(H9N2)(简称SH1)及其免疫逃逸株rSH1-HA_(D201N)。为了鉴定HA_(D201N)是否通过影响H9N2禽流感病毒复制能力而导致病毒发生免疫逃逸,用0.001 MOI的病毒接种MDCK并测定其生长曲线,结果表明HA_(D201N)点突变可显著降低rSH1病毒的复制能力,且病毒复制能力的变化不是rSH1病毒发生逃逸的主要原因。为了研究HA_(D201N)是否通过影响H9N2病毒抗原变异而产生病毒逃逸株,将原毒株与突变毒株加入佐剂后免疫鸡以制备多克隆抗体血清,利用交叉HI试验,计算R值并分析抗原变异,结果表明rSH1与rSH1-HA_(D201N)的R值为2,说明HA_(D201N)会导致rSH1发生显著的抗原变异,从而使病毒在免疫压力下逃逸。本研究为探索H9N2禽流感病毒抗原变异规律及其疫苗研发奠定了基础。

表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒构建及其免疫效果评估

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的二联疫苗候选株,试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统,以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体,构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的重组血清4型腺病毒;并通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、Westernblot试验以及SPF鸡保护性试验等方法,探究此重组病毒体外生物学特性并评估其为鸡提供的保护力。结果显示:研究成功构建能稳定表达H7N9禽流感亚型病毒HA蛋白的重组血清4型腺病毒,命名为FAdV4-H7;FAdV4-H7能在LMH细胞高效复制,并能在LMH细胞传代15次后仍能稳定表达HA蛋白;FAdV4-H7不仅高度致弱,而且能诱导机体产生高滴度针对H7N9亚型禽流感病毒HI抗体和FAdV-4的中和抗体,能为SPF鸡提供足够保护来抵抗致死性FAdV-4感染。研究表明,试验成功构建了重组病毒FAdV4-H7,为H7N9亚型禽流感病毒和FAdV-4的联防联控提供了二联苗候选疫苗株。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

上海地区活禽批发市场H9亚型禽流感病毒调查

为弄清上海地区活禽批发市场中H9禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的流行情况及鸡群的免疫情况,2009年对上海三大活禽批发市场进行了采样监测。采用HI试验检测H9 AIV抗体、荧光RT-PCR试验和鸡胚接种分离鉴定病毒。共采集110批次1 646份血样和喉头泄殖腔棉拭样品,平均抗体合格率为60.27%,分离到H9病毒134株,其中4-6月和9-11月为全年中病毒分离的2个高峰期（样品带毒率均超过了10.00%）,明显比其它月份要高（其他月份均低于5.00%）,样品带毒率平均为8.14%。不同市场、不同地区采集的样品其抗体合格率和样品的带毒率也存在一定的差异。在30批分离到病毒的样品中,13批次已免疫H9N2油乳剂灭活苗且抗体合格率均大于70.00%的样品中分离到45株病毒（45/195）,其中6批次抗体合格率达到100%的样品中也分离到了病毒（8/90）,但带毒率明显比未经疫苗免疫的样品（79/255）低。调查结果表明养殖户对肉鸡群H9N2油乳剂灭活苗免疫重视程度不够,鸡群中带毒现象较普遍。疫苗免疫后能产生较高的免疫抗体,且抗体能减轻临床症状,降低带毒率,但不能完全阻止病毒复制,存在高抗体下带毒现象。

H9N2亚型禽流感病毒感染鸡呼吸道应答模式研究

【目的】通过建立H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染鸡上呼吸道炎症模型,探索其感染鸡上呼吸道引起的炎症反应。【方法】将H9N2亚型AIV流行毒株GD10142,按照100μL/只(108 EID 50/100μL)的剂量通过滴鼻点眼方法感染SPF鸡,并在感染后观察鸡的临床特征,采集感染后0、1、3、5、7、9 d的咽拭子和血清样品;感染后5和9 d剖检观察鸡的呼吸道和肺脏病理变化,收集气管灌洗液、气管和肺脏组织;通过实时荧光定量PCR检测咽拭子、气管灌洗液、气管和肺脏组织中的病毒载量;应用ELISA方法检测感染后血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG的变化规律,通过血清中和试验分析血清中和抗体的活性;通过ELISA方法检测血清和气管灌洗液中炎症相关细胞因子白细胞介素6(IL-6)、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核转录因子κB(NF-κB)的水平。【结果】H9N2亚型AIV感染后鸡没有出现典型的临床特征,但感染后1~5 d在咽拭子中可检测到病毒核酸,且感染3 d后病毒载量最高,感染5 d后检测不到病毒核酸;感染5 d时,在气管灌洗液、气管和肺脏检测到病毒核酸,其中前两者载量高于肺脏;血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG在感染后3 d增多,感染后5~9 d维持较高水平,且具有较强的病毒中和活性;血清IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB也在感染后3 d开始呈上升趋势;但气管灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB含量很低,且感染前后无明显变化。【结论】本研究成功建立了H9N2亚型AIV感染鸡呼吸道模型,确定上呼吸道是H9N2亚型AIV主要感染和增殖部位,H9N2亚型AIV感染诱导机体产生促炎和抑炎细胞因子,可能是感染动物维持免疫稳态的重要因素。本研究为深入探索H9N2亚型AIV的致病机制和宿主防御机制奠定了基础。

鸽H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及致病性试验

H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流感病毒时有报道,这其中包括H5N1、H7N9以及H9N2亚型禽流感病毒。虽然H9N2亚型禽流感毒株的致病性相对于H5和H7亚型较低,但是该亚型病毒在我国家禽中存在较为普遍,且目前从鸽子已分离到重组的H9N2毒株,该毒株不仅引起鸽子感染而且具有优先与人类呼吸道表面受体结合的能力,因此加强流感病毒在鸽群中流行情况具有重要的现实意义。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

禽流感病毒(H9亚型)流行性毒株的分离、筛选与鉴定

为了明确2023年我国禽流感病毒H9N2亚型的流行情况,从北京、河北、河南、山东、山西、福建、四川、广西、辽宁等地养殖场送检的50份病料进行病毒分离鉴定,共分离到19株具有血凝性的培养物,对19个具有血凝性的培养物开展了血清学试验和RT-PCR试验初步鉴定,其中8株鉴定为H9N2亚型禽流感病毒,接下来对8株H9N2亚型禽流感病毒进行了HA基因测序与遗传进化分析,同时使用8株H9N2分离株以及目前普遍使用的H9亚型禽流感灭活疫苗的疫苗株制备灭活疫苗免疫SPF鸡制备高免血清,开展交叉血凝抑制试验,筛选出血清保护谱广的分离株BJ23株,然后使用BJ23株在SPF鸡中开展免疫攻毒保护研究。结果表明,分离株与我国目前普遍使用的H9亚型禽流感灭活疫苗株之间存在着一定的遗传距离,HA基因的核苷酸同源性为87.5%~93.1%,8株H9N2分离株同属于Y280种系;BJ23株对近年来分离的H9N2禽流感毒株交叉血凝保护谱广;使用BJ23株制备的灭活疫苗免疫SPF鸡后21日,使用8株分离株以及目前普遍使用的疫苗株WJ57株进行免疫后攻毒试验,BJ23株制备的疫苗不仅可以抵御同源毒株的攻击,而且对异源毒株的攻击也可提供理想的保护。结果表明,BJ23株适合作为疫苗候选株进行进一步研究。

我国部分地区H9亚型禽流感病毒血凝素基因序列比较与遗传发生关系分析

为从分子水平掌握我国H9亚型AIV的遗传变异情况和流行规律 ,本研究汇集近年来从我国 1 2个省、市、自治区的发病鸡群中分离到的 2 3株H9亚型禽流感病毒 ,通过RT -PCR方法和核苷酸序列测定获得了 2 3个毒株的HA基因cDNA核苷酸序列。核苷酸和推导的氨基酸序列同源性比较结果表明 ,这些毒株HA基因的核苷酸序列同源性为 94.1 %～1 0 0 % ,氨基酸序列同源性为 95 .4%～ 1 0 0 % ;将这 2 3个毒株和来自亚洲及世界其它地区的另外 3 1株的HA基因cDNA序列同源性进行比较发现 ,分离自香港的HK1 70 4 99株与日本的 2个毒株关系较近 ;氨基酸序列分析发现 ,CKGS1 99、CKTJ1 96、CKTJ2 96、CKSH3 0 0和CKBJ1 97五个毒株各发生了一个潜在的糖基化位点的丢失。 5 4株H9亚型AIVHA基因 5 5bp～ 1 1 5 2bp的氨基酸序列分析发现 ,裂解位点尽管有 1 0种基序 ,但本研究中的 2 3株和近年来从我国大陆和香港地区的分离的毒株则均为RSSR↓GLF ;构成受体结合位点的 1 91位氨基酸有一个规律 ,即所有中国大陆毒株与部分香港毒株都为N ,其它毒株均为H ,1 41aa～ 1 43aa处的糖基化位点有与 1 91aa类似的规律 ,即 :凡是 1 91aa为N的毒株 ,该处均为NVS(CKBJ1 94除外 ) ,凡是1 91aa为H的毒株 ,则该处均为NVT ;遗传发生关系分析 ,中国大陆?

H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立了一种适用于H9亚型禽流感病毒(AIV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法。方法根据GenBank中的H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,在保守区设计了一套针对HA基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果结果表明该方法对H3、H5、H7亚型AIV及其它禽呼吸道病原体均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,50min之内可完成反应;该方法对H9亚型AIV RNA的最小检测限为0.01pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。结论本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行H9亚型AIV的快速检测。

表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RT PCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒 (AIV)分离株 (A Chicken China F 1 998)的血凝素 (HA)基因 ,将其定向插入鸡痘病毒转移载体 1 1 75的痘苗病毒启动子P7 5的下游 ,得到重组转移载体 1 1 75HA。以脂质体转染法将 1 1 75HA转染至已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株(wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中 ,通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV HA。以间接免疫荧光法证实感染rFPV HA的CEF表达了HA。rFPV HA在免疫 7日龄SPF鸡 7天后即能诱生可检出的血凝抑制 (HI)抗体 ,1 4天后诱生的HI抗体到达高峰 ,且诱生的HI抗体保持较高水平达 5 5天。在 7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明 ,rFPV HV能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒 ,效果与AIV全病毒灭活苗相当。

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。

H7N9禽流感病毒对人类致病的分子基础分析

【目的】了解H7N9禽流感病毒对人类致病的分子特征,为更好地预防与治疗H7N9人禽流感提供科学依据。【方法】从GISAID数据库中下载中国2013年分离的所有H7N9禽流感病毒株的基因及蛋白序列,并从NCBI数据库中下载其他相关的流感病毒序列,运用生物信息学软件分析H7N9禽流感病毒基因的系统进化特征、受体结合位点、宿主特异位点、飞沫传播关键氨基酸位点、致病及毒力相关位点、耐药性位点及潜在糖基化位点等的变异情况。【结果】2013年中国流行的H7N9禽流感病毒为四源重组病毒,所有基因片段均来源于禽类,不含任何人流感病毒基因;病毒HA的受体结合位点发生了2个关键氨基酸的变异(G186V和Q226L);在与飞沫传播有关的关键氨基酸位点中,个别氨基酸已发生了变异(T160A、Q226L);该病毒具有8个毒力增强位点;所有分离株的M2均发生了S31N变异;分离株A/Shanghai/1/2013的NA的耐药位点发生了R294K变异;所有毒株的潜在糖基化位点均相对保守。【结论】H7N9禽流感病毒为四源重组的新型禽流感病毒。该病毒具有与人呼吸道上皮细胞SAa-2,6 Gal受体结合的分子基础,但目前尚未获得经飞沫传播的充分条件,人传人的可能性不大。该病毒具有低致病性禽流感病毒的分子特征,表明对禽类致病性不强,但其对人类呈高致病性,这可能与其毒力位点的特征有关。所有分离毒株均发生了对离子通道抑制剂金刚烷胺类药物的耐药性突变,个别毒株已发生了对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(达菲)的耐药性突变。

两株人H7N9禽流感病毒的全基因组测序及分子特征分析

【目的】对两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的人H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,研究其来源、基因组特征以及相互间的分子差异,旨在了解毒株的遗传进化特征与其致病性及其所致疾病临床类型的关系,为进一步阐明H7N9禽流感病毒的致病机制提供科学依据。【方法】选取两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的H7N9禽流感病毒进行全基因组序列测定;运用生物信息学软件比较分析两株病毒的遗传进化关系、基因组特征、受体结合位点、宿主特异性位点及致病相关位点等重要分子特征;从禽流感共享数据(GISAID)下载2013年至2014年10月轻症和重症病例的病毒分离株序列,分析致病相关关键位点差异,并分析这些变异与其致病性及所致疾病临床类型的关系。【结果】这两株H7N9禽流感病毒的HA、NA和M基因来源于2013年华东地区流行的H7N9禽流感病毒,NP、NS、PA、PB1和PB2基因来源于2013年在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒;H7N9禽流感病毒PA蛋白L336M和PB1蛋白I368V的突变率随流行时间的延长而逐渐上升,并存在地区差异;两株病毒各基因核苷酸同源性达到99.2%以上,氨基酸同源性在99.5%以上,但各基因节段存在个别氨基酸的差异,其中HA受体结合位点存在一个关键氨基酸的差异(226L和226 Q),宿主特异性位点存在两个关键氨基酸的差异(PB2-591L和PB2-591Q,PB2-627E和PB2-627K),毒力位点存在两个关键氨基酸差异(PA-353R和PA-353K,PB2-627E和PB2-627K);M2均发生了S31N突变;潜在糖基化位点均相对保守;2013年至2014年10月报道的重症病例病毒分离株PB2蛋白E627K突变率高于轻症病例分离株。【结论】两株来自不同临床类型的H7N9禽流感病毒是一种新的重组病毒,是由华东地区流行的人H7N9禽流感病毒和在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒基因重组而来;H7N9禽流感病毒的某些致病相关的关键氨基酸位点在流行的过程中不断发生变异,必须密切监测毒株的变异动向;两株致病力不同的病毒各基因节段虽然同源性较高,但存在关键氨基酸位点的差异,其中PB2蛋白627位氨基酸位点的差异可能对病毒的致病性起重要作用,与所致疾病临床类型相关。

H9N2亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析

用RT PCR技术及cDNA末端快速扩增法获得禽流感病毒分离株A Chicken Shanghai F 98(H9N2 )代表基因组全长的 8个基因片段。基因组序列比较及遗传进化分析结果表明 ,Chicken Shanghai F 98的 8个基因均不属于Quail HongKong G1 97亚系 ,与香港禽流感事件没有直接关系。它与Chicken Beijing 1 94的HA、NA、M、NS基因同源率分别为 96 7%、96 4%、97 5 %和 98 0 % ,这 4个基因属于Chicken Beijing 1 94亚系 ,其中 ,NA基因与Duck HongKong Y2 80 97的同源率为 97 4% ,而且它们均在 2 0 5位后缺失 9个核苷酸。而PB2、PB1、PA和NP基因与已知的 3个亚系关系较远 ,分别在相应的进化树上另成分支。因此 ,Chicken Shanghai F 98是两个以上不同基因亚系间发生自然重排的产物。

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10^3 TCID50免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(10^3-10^6TCID50)rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以108EID50的剂量静脉注射H9N2AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10^3 TCID50免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-Δg E-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10^3TCID50剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而10^4-10^6TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:22.4-1:23。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10^3、10^4、10^6TCID50免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10^5TCID50免疫组保护率为80%(4/5),1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

安徽省人感染H7N9禽流感病毒基因组特征分析

目的 分析安徽省2013年分离的5株人感染H7N9禽流感病毒全基因组特征.方法 从美国国家生物技术信息中心（NCBI）和全球禽流感基因共享数据库（GISAID）中下载具有代表性的H7N9、H7N3、H7N7和H9N2等毒株序列,运用分子生物信息学软件分析病毒全基因组特征.结果 我省流行的H7N9病毒HA基因与A/duck/Fujian/6390/2010（H7N3）相似度最高,NA基因与A/northern shoveler/Hong Kong/MPL133/2010（H2N9）株相似度最高,6个内部基因片段与中国北京、香港、湖南、江苏地区分离的H9N2毒株相似度接近.氨基酸序列比对发现NS1蛋白218～230位氨基酸缺失、M2蛋白的N31S突变、HA蛋白的G186V、Q226L突变以及NA蛋白69～73位的删除,并且我省人感染H7N9病毒均带有PB2的E627K突变,同时PA-100A、PA-356R、PA-409N这些易感人类的特征氨基酸也在本次流行的H7N9病毒中发现;此外HA蛋白裂解位点仅有1个碱性氨基酸、糖基化位点高度保守以及未发现NA蛋白R294K突变也是我省H7N9病毒主要特征.结论 我省人感染H7N9病毒与中国其他省份流行株高度同源,该病毒获得跨种传播、毒力增强、耐药等能力均与病毒蛋白功能域有关.

封闭式饲养鸡场H9N2亚型禽流感病毒HA基因在5年内的遗传变异

选择一个于 1 998年开始发生H9亚型禽流感的封闭式大型养鸡场 ,连续 5年内分离到 2 2株H9N2亚型病毒 ,对其中 9株与 1 998年分离株进行HA基因序列和病毒抗原性的比较结果表明 ,这些分离株均与 1 998年的具有较高的序列同源性 ,且在本研究期内HA基因的这些变化尚未产生引起交叉保护性改变。初步推断这些分离株均系 1 998年分离株在场内循环传播变化得来 ,其HA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。这为进一步研究禽流感病毒变异的规律和制定正确的禽流感防治对策具有重要意义。

微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究

目的探索H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)在微载体大规模培养的MDCK细胞中的增殖规律,确定最佳增殖条件。方法将H9N2亚型禽流感病毒株接种到生长在24孔培养板上的MDCK细胞中进行增殖试验,检测接种不同感染剂量病毒、添加不同浓度TPCK-胰酶、在不同pH值的培养液中培养,接毒后不同时间的病毒血凝素滴度(HA)。根据最佳增殖条件将病毒接种至生长在微载体上的MDCK细胞中,利用250 mL和5L转瓶逐级进行大规模增殖。结果最佳病毒增殖条件为TPCK-胰酶终浓度为10μg/mL,接毒剂量为MOI=0.025,培养液pH值为7.4,在此条件下,H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)适应在250 mL和5L转瓶中微载体培养的MDCK细胞内大量增殖,病毒的最高血凝价均可达到9log2(1∶512)。结论本研究为以哺乳动物细胞为基质规模化生产禽流感疫苗奠定了基础。