BM-MSCs来源外泌体介导铁死亡减轻大鼠心肌细胞系H9c2缺氧/复氧损伤

目的探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源外泌体对大鼠心肌细胞系H9c2缺氧/复氧(A/R)损伤的保护作用及其分子机制。方法构建H9c2细胞A/R损伤模型;采用电镜、Western blot鉴定BM-MSCs来源外泌体(BM-MSCs-exos);PHK26红色荧光标记外泌体并观察H9c2细胞内吞现象;采用CCK-8法检测细胞活力,EdU细胞增殖实验检测细胞增殖活性;铁死亡相关检测试剂盒测定Fe 2+、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量,流式细胞测量术检测活性氧自由基(ROS)水平。结果成功鉴定BM-MSCs-exo并观察到H9c2细胞内吞外泌体;与A/R组比较,A/R+BM-MSCs-exo组细胞活力与增殖能力得到明显改善(P<0.05);铁死亡标志蛋白GPX4、SLC7A11升高,转铁蛋白受体1(TFR1)表达降低(P<0.05);Fe 2+离子、MDA、ROS水平降低,GSH水平升高(P<0.05)。铁死亡诱导剂Erastin处理后,发现BM-MSCs-exo对H9c2细胞A/R损伤的保护作用显著降低(P<0.05)。结论BM-MSCs-exos可减轻A/R诱导的心肌细胞系损伤,其机制可能是通过抑制心肌细胞铁死亡介导的BM-MSCs-exos。

慢病毒转染稳定表达GFP融合自噬蛋白LC3大鼠H9c2心肌细胞系的建立

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(GFP-LC3)的大鼠心肌细胞H9c2细胞系。方法构建MSCV-GFP-LC3表达载体,应用转染技术将该质粒导入H9c2细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系。载体细胞与心肌细胞中GFP-LC3的表达分别用荧光显微镜与共聚焦显微镜及Western blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察应激时细胞发生自噬的情况。结果成功获得一株转染并经G418反复筛选的H9c2细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-LC3融合蛋白的表达。激光共聚焦显微镜证明给予自噬诱导剂Rapamycin可诱导自噬的发生。结论用MSCV-GFP-LC3转染的H9c2细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型。

Klotho蛋白减轻低氧/复氧诱导的心肌细胞系H9C2损伤

目的研究Klotho蛋白对低氧-复氧诱导的心肌H9C2细胞系损伤的保护作用及其机制。方法将H9C2心肌细胞分为对照组、低氧/复氧组(1%O_2低氧6 h, 5%CO_2以及95%空气培养箱中复氧2 h)和Klotho蛋白(10μg/mL)干预组。通过酶标仪间接测定细胞内钙离子([Ca^(2+)]_i)水平;CCK8法和TUNEL法分别检测细胞活性及细胞凋亡;分光光度法检测细胞中钠ATP酶(Na^+/K^+-ATPase,NKA)和反向模式钠/钙交换体(Na^+/Ca^(2+)-exchange,NCX)的活性。结果体外培养的H9C2细胞低氧/复氧(6 h/2 h)处理后可明显降低H9C2细胞活性(P<0.05);增加细胞内Ca^(2+)水平和凋亡率(P<0.05);降低细胞中Na^+/K^+-ATPase的活性(P<0.05);增加反向模式Na^+/Ca^(2+)交换体的活性(P<0.05);10μg/mL Klotho蛋白处理可明显减轻上述损伤。结论 Klotho蛋白可减轻低氧/复氧诱导下的H9C2细胞内钙超载,最终减少该细胞系细胞的凋亡。

Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染H9c2细胞系的构建

运用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)构建pSUPER.retro-Smyd1真核表达质粒,经鉴定后用脂质体法转染H9c2细胞,通过G418筛选出稳定表达pSUPER.retro-Smyd1的细胞系,最后经Western blot及RT-PCR实验鉴定其干扰效果。经鉴定,通过H9c2细胞系构建的pSUPER.retro-Smyd1干扰细胞系的干扰效果显著。因此,本实验成功构建了Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染的H9c2细胞系,为进一步研究Smyd1基因在心脏发育中的作用奠定了良好的实验基础。

大鼠心肌细胞和心肌细胞系H9C2表达弹性蛋白

目的检测弹性蛋白在大鼠心肌细胞和H9C2心肌细胞系内的表达。方法取新生和成年SD大鼠各5例的新鲜心脏,冷冻切片;取20只新生3 d SD大鼠心脏,通过0.05%胰蛋白酶和0.075%Ⅱ型胶原酶消化法,获取原代心肌细胞;免疫组织化学和免疫荧光技术检测大鼠心肌组织、原代心肌细胞和H9C2心肌细胞系的弹性蛋白表达;ELISA法检测培养的H9C2心肌细胞系上清中的弹性蛋白。结果在大鼠心肌细胞、H9C2心肌细胞系和新生、成年大鼠心肌组织上均发现心肌肌钙蛋白T和弹性蛋白的共表达。免疫组织化学结果发现,弹性蛋白在成纤维细胞、平滑肌细胞和细胞间质内均有表达。H9C2心肌细胞培养液的上清中检测到少量的弹性蛋白。结论大鼠心肌细胞表达弹性蛋白,可能参与心肌细胞的势能和细胞间质弹性纤维的构建。

当归多糖促进大鼠心肌细胞系H9c2增殖

目的研究当归多糖(APS)对大鼠心肌细胞系H9c2增殖和凋亡的影响。方法将大鼠心肌细胞系H9c2分为对照组(control组)、阿霉素(ADR)诱导H9c2细胞复制扩张性心肌病心肌细胞组(ADR组)、APS干预(APS组)、转染anti-miR-NC(APS+anti-miR-NC组)及转染anti-miR-4701-3p(APS+anti-miR-4701-3p组)。采用流式细胞计量术检测细胞凋亡,Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达,酶联免疫(ELISA)法检测B型脑钠肽(BNP)水平,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞的增殖,实时定量PCR(RT-qPCR)检测微小RNA-4701-3p(miR-4701-3p)表达。结果阿霉素明显提高H9c2细胞的BNP含量、细胞凋亡率、Bax蛋白水平,显著降低Bcl-2蛋白表达量(P<0.05)。当归多糖明显增加阿霉素诱导后H9c2细胞的细胞活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量和miR-4701-3p表达量,显著减少细胞的凋亡率、Bax蛋白表达量(P<0.05)。敲减miR-4701-3p明显降低当归多糖作用的扩张性心肌病H9c2细胞的细胞活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平,而显著提高其凋亡率、Bax蛋白表达量(P<0.05)。结论当归多糖通过上调miR-4701-3p的表达,促进阿霉素诱导的扩张性心肌病大鼠心肌细胞系H9c2增殖。

MicroRNA-4279通过靶向核心启动子区域上调Notch-1基因表达进而抑制细胞凋亡

【目的】寻找与Notch-1基因核心启动子结合的micro RNA(miRNA)并阐明其调控功能,研究免疫细胞肿瘤的发生发展机制。【方法】首先使用生物信息学手段筛选与Notch-1基因核心启动子区域结合的miRNA,进而利用荧光素酶报告系统对其调控作用进行实验验证;通过突变核心启动子上的结合位点进一步确定该miRNA特异性靶向基因核心启动子区域。检测转染该miRNA后H9细胞中Notch-1的mRNA与内源蛋白表达水平。另外通过转染该miRNA并用H2O2诱导凋亡,研究该miRNA对H9细胞凋亡的影响。进一步在上述实验条件下,使用siRNA降低靶基因(Notch-1)的表达,然后检测miRNA对H9细胞系的凋亡的影响。【结果】首先通过软件预测,我们发现了miR-4279可以与Notch-1的核心启动子序列结合。荧光素酶报告实验表明miR-4279可以增强Notch-1启动子的转录活性;而在miR-4279的靶位点引入突变后,该增强作用消失。RT-qPCR和Western Blot实验表明miR-4279能够显著增强内源Notch-1 mRNA与蛋白的表达。H2O2诱导凋亡实验表明,miR-4279可以抑制H9细胞的凋亡。siRNA干扰实验表明,当Notch-1通路被抑制后,miR-4279导致的细胞凋亡抑制的效果消失。【结论】miR-4279通过靶向Notch-1基因核心启动子区域,特异性增加Notch-1基因的表达,进而增强H9细胞对H2O2诱导的凋亡的抗性。

奥氮平增加大鼠H9C2心肌细胞巨噬细胞迁移抑制因子基因和蛋白表达

目的通过奥氮平处理心肌细胞来探讨奥氮平诱导心血管疾病的机制。方法用不同浓度(10,20和40uM)及不同作用时间(1,3,12和24 h)的奥氮平处理大鼠心肌细胞H9C2,检测巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在mRNA及蛋白水平的表达。结果用不同浓度、不同时间的奥氮平处理H9c2细胞时,随着处理浓度的增加及时间的延长,MIF mRNA及MIF蛋白随着浓度的递增及时间的延长而增高(P<0.05)。结论奥氮平处理心肌细胞后,MIF的mRNA及蛋白均发生显著改变,这种改变存在浓度与时间的依赖关系,MIF可能参与奥氮平诱导的心血管系统损伤。

CPUHY002对大鼠心肌细胞瞬时外向钾电流的影响

目的观察一种新合成的磷酸二酯酶Ⅲ(PDEⅢ)抑制剂CPUHY002对大鼠心肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的影响。方法采用全细胞膜片钳技术考察CPUHY002对急性分离大鼠心肌细胞和H9c2细胞系Ito的作用。结果在+50 mV下,CPUHY002对急性分离细胞和H9c2细胞系的Ito呈浓度依赖性抑制,其半数有效抑制浓度(IC50)分别为0.98μmol/L和0.91μmol/L;1μmol/L CPUHY002可使I-V曲线明显下移,Ito峰值分别下降(39.10±2.30)%和(47.32±2.06)%,激活曲线右移,失活曲线左移(未见于H9c2),恢复曲线无显著变化。结论 CPUHY002可浓度依赖性地抑制大鼠心肌细胞Ito。

血管紧张素Ⅱ通过CaMKⅡ诱导心肌细胞自噬

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大过程中是否有细胞自噬的参与,以及钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在该过程中的作用。方法 体外培养H9C2细胞系,将细胞随机分为正常对照组、AngⅡ处理组、坎地沙坦处理AngⅡ组、KN-62处理AngⅡ组。通过激光共聚焦观察心肌细胞肥大情况;荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测CaMKⅡmRNA表达情况;Western blot检测CaMKⅡ蛋白及相关蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1)的水平。结果 AngⅡ能够诱导心肌细胞肥大。与正常对照组相比,AngⅡ处理组CaMKⅡmRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);坎地沙坦能够抑制AngⅡ诱导的CaMKⅡmRNA及蛋白表达升高(P<0.05)。与正常对照组相比,AngⅡ处理组的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平明显升高(P<0.05);坎地沙坦和KN-62均能降低LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平(P<0.05)。结论 CaMKⅡ可能不仅参与AngⅡ诱导心肌肥大,而且参与细胞自噬。

左西孟旦通过调控EGOT/微小RNA-641对缺氧/复氧心肌细胞纤维化的影响

目的 探讨左西孟旦(Lev)是否通过调控长链非编码RNA(LncRNA)嗜酸性粒细胞个体发育转录本(EGOT)/微小RNA(miR)-641分子轴从而影响缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞增殖、凋亡及纤维化。方法 体外培养大鼠心肌细胞系H9C2,H/R处理细胞建立细胞损伤模型,随机分为对照(control)组、H/R组、H/R+Lev 1μmol/L (H/R+Lev-L)组、H/R+Lev 5μmol/L(H/R+Lev-M)组和H/R+Lev 10μmol/L(H/R+Lev-H)组,每组9例;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;Real-time PCR检测EGOT、miR-641的mRNA表达水平;分别将pcDNA-EGOT、EGOT小分子干扰RNA(si-EGOT)转染至H9C2细胞,采用上述方法检测细胞增殖及凋亡率;双荧光素酶报告基因实验验证EGOT和miR-641的靶向关系;Western blotting检测Bax、Bcl-2、胶原蛋白Ⅰ型(ColⅠ)、胶原蛋白Ⅲ型(ColⅢ)、组织金属蛋白酶抑制因子2(TIMP2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。结果 与control组比较,H/R组细胞存活率降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),Bax、ColⅠ、ColⅢ、TIMP2和MMP-2蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),EGOT的表达水平降低(P<0.05),miR-641的表达水平升高(P<0.05);与H/R组比较,H/R+Lev-L组、H/R+Lev-M组及H/R+Lev-H组细胞存活率升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),Bax、ColⅠ、ColⅢ、TIMP2和MMP-2蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05),EGOT的表达水平升高(P<0.05),miR-641的表达水平降低(P<0.05),且H/R+Lev-L组、H/R+Lev-M组、H/R+Lev-H组各指标比较差异有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实EGOT可靶向结合miR-641;转染pcDNA-EGOT与Lev的作用相似;转染si-EGOT可降低Lev对H/R诱导的H9C2细胞增殖、凋亡及纤维化的作用。结论 左西孟旦可能通过上调EGOT表达及下调miR-641表达而促进H/R诱导的H9C2细胞增殖及抑制细胞凋亡、纤维化。

基于HSF1高表达H9c2细胞的参芎葡萄糖注射液抗氧化损伤作用探讨

目的：建立热休克转录因子1（HSF1）高表达的H9c2细胞系,考察在HSF1高表达的情况下参芎葡萄糖注射液（SGI）对过氧化氢（H2O2）诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用。方法：构建GV1422-HSF1的重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至H9c2细胞中,用遗传霉素（G418）来筛选稳定转染细胞株,并用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测HSF1和热休克蛋白70（HSP70）mRNA和蛋白的表达情况,来鉴定HSF1高表达的H9c2细胞系（H9c2-HSF1）是否建立成功。用H2O2（300μmol·L-1）处理H9c2-HSF1细胞0.5 h构建氧化损伤模型,考察HSF1高表达的情况下参芎葡萄糖注射液预处理对细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）漏出量、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响,同时Western blot检测HSF1和HSP70蛋白表达情况。结果：Real-time PCR和Western blot实验结果显示：筛选出来的稳定转染细胞的HSF1和HSP70蛋白表达显著上调（P〈0.01）,表明H9c2-HSF1细胞系构建成功。经参芎葡萄糖注射液预处理6 h,H2O2损伤0.5 h后,与H9c2＋H2O2组和H9c2-HSF1＋H2O2组比较,对应给药组细胞的HSF1和HSP70蛋白表达显著上调（P〈0.01）,细胞存活率显著增高（P〈0.01）,LDH,CK释放量和MDA含量显著减少（P〈0.01）;ROS含量显著降低,GSH-Px和SOD活性明显升高。结论：本研究成功构建了HSF1高表达H9c2细胞系,并发现HSF1高表达能明显增强参芎葡萄糖注射液抗氧化损伤作用,其机制可能不在于增加细胞清除ROS能力,但可能与上调HSP70表达相关,需要进一步研究。

甲基苯丙胺诱导心肌细胞自噬作用的发生

目的探讨甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)引起心肌细胞发生自噬现象的过程。方法体内实验:将60只约6周龄的雄性C57Bl/6J小鼠随机(随机数字法)分为3组(对照组、3 d染毒组、7 d染毒组),每组20只,建立METH染毒模型。染毒组小鼠给予腹腔注射单次剂量15 mg/kg METH,2次/d,分别染毒3 d或7 d。对照组小鼠相同时间点给予腹腔注射0.9%的生理盐水共7 d。最后一次腹腔注射24 h后收获小鼠心脏。Western blot法检测心肌自噬相关蛋白的表达。体外实验:心肌细胞系(H9C2)分为两组,对照组(正常培养基),METH组(用900 mmol/mL的培养基干预24 h)。Western blot、免疫荧光检测细胞中自噬相关蛋白表达;透射电子显微镜观察细胞内自噬现象。结果在体内实验和体外实验中,甲基苯丙胺干预后,心脏自噬相关蛋白p62,Beclin-1和LC3表达量与对照组相比均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05);激光共聚焦检测免疫荧光结果示,METH组心肌细胞LC3-Ⅱ较对照组明显增多;电镜结果显示,与对照组相比,METH组细胞的自噬体数量明显增多。结论甲基苯丙胺可激活心肌细胞的自噬程序。