稳定高表达TGF-β_1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株的构建及鉴定

目的构建及鉴定稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株。方法利用RNA干扰技术提取p EGFP-TGF-β1质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒转染到大鼠心肌细胞H9c2细胞株,利用G418筛选转染的H9c2细胞,通过RT-PCR和Western blot技术对转染后的H9c2细胞进行鉴定,本实验将转染了p EGFP-TGF-β1质粒和p EGFP对照质粒的细胞株分为p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组。结果 p EGFP-TGF-β1质粒测序结果包含TGF-β1序列,筛选后的p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组细胞转染效率分别为85%和93%。RT-PCR结果显示,p EGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1m RNA相对表达量为(2.563±0.198),与对照组(1.037±0.022)比较差异具有统计学意义(t=3.056,P=0.028);Western blot结果显示,p EGFPTGF-β1质粒转染组的TGF-β1蛋白相对表达量为(3.275±0.234),显著高于对照组的(1.011±0.015),差异具有统计学意义(t=4.372,P=0.015)。结论本研究所构建的大鼠心肌细胞H9c2细胞株能稳定高表达TGF-β1,可用于后续TGF-β1在大鼠心肌细胞的生物学作用及相关信号通路的研究。

基于H9C2细胞株的ADRB1基因多态性稳定过表达模型的构建

目的构建β1肾上腺素能受体(ADRB1,1165G>C)基因多态性稳定过表达的心肌细胞模型,为其在高血压、心力衰竭及不良心血管事件中的功能及机制研究奠定了实验基础。方法将ADRB1cDNA克隆片段和PMT399载体连接后获得pSE4077和pSE4078重组质粒,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集上清液感染H9C2细胞,利用定量聚合酶链式反应(QPCR)方法筛选稳转细胞株。结果pSE4077和pSE4078组的ADRB1蛋白表达水平显著高于未转染的细胞对照组和转染空病毒的对照组,且pSE4078组也高于pSE4077组。结论基于H9C2细胞株的ADRB1基多态性稳定过表达模型构建成功。

血管紧张素Ⅱ对H9C2细胞中NLRP3炎性体的作用

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对H9C2细胞中NLRP3的作用。方法培养H9C2细胞株,选用对数生长期的H9C2细胞进行试验,用10^(-6)mol/l的AngⅡ予以刺激,于不同的时间点收集细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及蛋白质印迹法(Western blot)分别检测细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的基因和蛋白水平;通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养液上清液中IL-1β的含量。结果 NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β的基因相对表达量在各处理组与0h组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase-1及IL-1β的蛋白相对表达量在各处理组与0h组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞培养液上清液中IL-1β的含量在各处理组与0h组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论血管紧张素Ⅱ可促使H9C2细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因及蛋白表达水平增加,同时也可使细胞培养液上清液中IL-1β的含量增加;AngⅡ可通过激活NLRP3炎性小体导致心肌细胞慢性炎症的发生而导致心肌重构,参与心肌病的发生发展过程。

Ghrelin预处理对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的探讨Ghrelin预处理对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法培养H9C2心肌细胞并建立心肌细胞缺氧(21 h)/复氧(6 h)模型。细胞随机分成4组:对照组,缺氧/复氧组(H/R组),缺氧/复氧+Ghrelin组(H/R+G组),缺氧/复氧+Ghrelin+生长激素促分泌素受体(GHSR)-siRNA组(H/R+G+G-siRNA组);采用siRNA干扰技术阻断Ghrelin受体GHSR的表达以及Hoechst 33258染色剂和流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组凋亡相关蛋白表达情况。结果 GHSR存在于正常H9C2心肌细胞中,GHSR-siRNA可以显著抑制H9C2心肌细胞中GHSR的表达。与H/R组相比,在H/R+G组中缺氧/复氧损伤所导致心肌细胞的凋亡率明显下降(P<0.05),B淋巴细胞瘤-2蛋白/Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2/Bax)比率明显上调(P<0.05),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)表达水平被显著抑制(P<0.05)。而与H/R+G组相比,H/R+G+G-siRNA组心肌细胞凋亡率增加(P<0.05),Bcl-2/Bax比率显著下降(P<0.05),caspase-3表达上调(P<0.05)。结论 Ghrelin具有减轻缺氧/复氧所引起的心肌细胞损伤、抑制心肌细胞凋亡的作用。

靶向CrkL基因的siRNA真核表达载体的构建及对H9C2心肌细胞凋亡的作用

为研究CrkL基因在心肌细胞中的作用机制提供实验基础,首先体外合成6个针对大鼠CrkL基因的特异反义脱氧寡核苷酸序列,定向克隆至pSR-GFP/neo siRNA真核表达质粒中,经双酶切和测序证实重组载体pSR-GFP/neo-CrkLi构建成功.然后将其转染入大鼠H9C2心肌细胞内,用荧光显微镜观察其转染率,RT-PCR法鉴定其对CrkL mRNA表达的抑制作用.流式细胞仪检测转染前后H9C2细胞凋亡率.所有pSR-GFP/neo-CrkLi载体均能高效率的转染H9C2细胞,但只有3个载体能显著抑制CrkL mRNA的表达.其中pSR-GFP/neo-CrkLi3效果最佳,其转染H9C2细胞后,该组H9C2细胞凋亡率明显高于其他两组(P=0.001).

基于氧化应激探索木犀草素对缺氧-复氧损害的H9c2心肌细胞的保护作用

目的基于氧化应激探索木犀草素对缺氧-复氧损害的H9c2心肌细胞的保护作用。方法在体外木犀草素培养后,再缺氧-复氧培养H9c2心肌细胞模拟缺血再灌注为实验组,以正常培养细胞为对照组,以仅缺氧-复氧培养细胞为缺氧-复氧组。观察细胞形态;流式检测细胞凋亡情况;生化检测细胞丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、谷胱甘肽(GSH)含量;实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)、血红素加氧酶(HO-1)、NAD(P)H醌氧化还原酶(NQO1)mRNA表达;蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白含量。结果缺氧-复氧诱导H9c2细胞凋亡[(8.14±1.13)比(72.37±6.98),t=15.733,P=0.000]及促进Bax蛋白表达[(0.38±0.04)比(1.01±0.09),t=11.079,P=0.000],抑制Bcl-2蛋白表达[(0.83±0.06)比0.43±0.04,t=9.608,P=0.001],木犀草素可浓度依赖的抑制细胞凋亡[(72.37±6.98)比(41.38±4.32)、(29.67±5.67),t1=6.539,P=0.003;t2=8.224,P=0.001]及Bax蛋白表达[(1.01±0.09)比(0.71±0.06)、(0.45±0.03),t1=4.979,P=0.008;t2=10.224,P=0.001],增加Bcl-2蛋白表达[(0.43±0.04)比(0.63±0.04)、(0.74±0.05),t1=6.124,P=0.004;t2=8.386,P=0.001];在氧化应激层面,木犀草素可降低由缺氧-复氧引起的MDA、8-OHdG升高[MDA:(1.73±0.12)nmol/mg比(1.12±0.11)nmol/mg、(0.82±0.06)nmol/mg、(0.63±0.04)nmol/mg,t1=5.879,P=0.004;t2=11.748,P=0.000;t3=15.062,P=0.000;8-OHdG:(316.37±21.53)ng/L比(253.26±19.33)ng/L、(211.45±20.98)ng/L、(189.15±18.01)ng/L,t1=3.778,P=0.019;t2=6.054,P=0.004;t3=7.850,P=0.001],升高由缺氧-复氧引起的GSH含量[(88.59±7.99)nmol/mg比(142.19±12.31)nmol/mg、(178.67±16.78)nmol/mg,t1=6.326,P=0.003;t2=8.395,P=0.001]以及γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA的表达下调[γ-GCS:(0.67±0.07)比(0.85±0.07)、(1.02±0.11),t1=3.149,P=0.035;t2=4.649,P=0.010;HO-1:(0.41±0.03)比(0.63±0.06)、(0.82±0.07)、(0.95±0.10),t1=5.945,P=0.004;t2=9.624,P=0.001;t3=9.126,P=0.001;NQO1:(0.51±0.04)比(0.73±0.06)、(0.82±0.08)、(1.15±0.12),t1=5.284,P=0.006;t2=6.003,P=0.004;t3=8.764,P=0.001];进一步发现木犀草素可导致Nrf2蛋白的进一步升高[(0.62±0.05)比(0.85±0.07)、(0.97±0.08),t1=4.631,P=0.010;t2=6.426,P=0.003]以及Keap1进一步下调[(0.72±0.04)比(0.28±0.02)、(0.15±0.01),t1=17.041,P=0.000;t2=23.945,P=0.000]。结论木犀草素可作用于Nrf2-(抗氧化响应元件)ARE通路,激活该信号通路后,可增加H9c2细胞中抗氧自由基酶的表达量,并降低由缺氧-复氧培养所引起的H9c2细胞的氧化应激水平,抑制心肌细胞凋亡,保护心肌细胞免受缺氧-复氧损伤。

微小RNA对心肌细胞C反应蛋白功能水平的调节

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)基因调节机制对冠心病标志性分子C反应蛋白(CRP)的调节。方法以大鼠心肌细胞H9c2(2-1)为实验对象,在培养中进行miR312的增强和抑制处理:加入Pre-miR-132作为miR-132增强剂,Pre-miR miRNA前体分子阴性对照1号作为增强处理的对照;加入Anti-miR-132作为miRNA-132抑制剂,Anti-miR miRNA抑制剂阴性对照1号作为抑制处理的对照。用iFect转染后培养48 h,收集细胞进行CRP的蛋白免疫印迹杂交。结果大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)在增强剂Pre-miR-132处理48 h后,CRP蛋白水平明显下降(t-检验,P=0.013 21);与此同时,抑制剂Anti-miR-132处理48 h后,CRP蛋白水平出现了明显上升(t-检验,P=0.012 40)。结论微小RNA miR-132对大鼠心肌细胞CRP功能水平具有显著的调节作用,二者呈负相关关系。

MafK通过p65乙酰化对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的探究MafK对大鼠心肌细胞(H9c2)缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及相关机制。方法将H9c2细胞随机分为对照组、H/R组、抑制对照组和MafK抑制组。对照组(按H9c2细胞的正常培养方式进行处理)、H/R组(H9c2细胞进行缺氧4 h/复氧12 h的处理)、抑制对照组(H9c2细胞转染空白对照siRNA-NC 48 h后进行H/R处理)和MafK抑制组(H9c2细胞转染siRNA-MafK 48 h后进行H/R处理)。CCK-8法检测各组细胞的活性;ELISA法检测各组TNF-α和IL-6的表达水平;Caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞的Caspase-3活性;Western blot检测各组细胞的MafK蛋白、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3)和NF-κB p65乙酰化蛋白的表达水平。结果与对照组相比,MafK在H/R组中的表达水平显著升高(P<0.01)。与抑制对照组相比,敲低MafK可以显著降低MafK在H/R处理下的H9c2细胞中的表达水平(P<0.05)。与对照组相比,H/R组H9c2细胞活性降至(47.07±4.07)%(P<0.05),而TNF-α和IL-6的表达水平则由原来的(12.78±2.11)pg/mL、(45.01±4.07)pg/mL提升至(88.90±7.34)pg/mL(P<0.05)、(148.36±13.36)pg/mL(P<0.05),并且Caspase-3活性A值由0.21±0.01提升至0.52±0.02(P<0.05),促进了H9c2的炎症和凋亡。而敲低MafK使H9c2细胞活性由(48.20±3.09%)提升至(74.90±5.54)%(P<0.05),并将TNF-α和IL-6的表达水平则由原来的(93.55±8.53)pg/mL、(151.52±9.55)pg/mL降低至(64.99±5.47)pg/mL(P<0.05)、(102.24±6.79)pg/mL(P<0.05)。此外,使Caspase-3活性A值由0.53±0.04降至0.34±0.03(P<0.05),表明敲低MafK将逆转由H/R引起的炎症和凋亡的变化。与抑制对照组相比,敲低MafK可以显著抑制Bax和Cleaved Caspase-3的表达而促进Bcl-2的表达。最后,敲低MafK还可以显著抑制NF-κB p65乙酰化蛋白的表达水平。结论抑制Mafk可以有效减轻缺氧/复氧对心肌细胞的损伤,其机制可能与调控p65乙酰化有关。

蒽环类药物心肌损害的体外实验

目的研究蒽环类化疗药物对心肌细胞的损害作用。方法体外传代培养H9c2乳鼠心肌细胞株,细胞传代第3天加入蒽环类药物柔红霉素(DNR)共培养,测定细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)浓度,以反映心肌细胞膜损害程度;采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测心肌细胞生长抑制率,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。结果①DNR1组、DNR2组、DNR3组的H9c2细胞生长抑制率分别为(24.93±1.52)%、(17.15±2.03)%和(13.48±2.26)%,3组间差异有统计学意义(P<0.01)。②DNR1、DNR2、DNR3组H9c2细胞上清液的LDH浓度分别为(77.00±6.24)、(64.3±10.50)和(5 7.67±7.24)U,均显著高于空白对照组的(37.00±6.56)U(P值均<0.01)。③DNR1、DNR2、DNR3组的H9c2细胞凋亡率分别为(15.47±2.46)%、(9.82±2.08)%和(9.43±1.63)%,均显著高于空白对照组的(4.49±2.96)%(P值均<0.05)。结论DNR能抑制心肌细胞生长,促进凋亡,同时具有对心肌细胞膜的损害作用。