神经介素B及受体NMBR和PD-L1在H9N2亚型流感病毒感染过程中的相互作用研究

神经介素B(NMB)及其G蛋白偶联受体(NMBR)发挥的抗甲型流感病毒免疫反应,以及甲型流感病毒感染诱导细胞程序性死亡配体1(PD-L1)高表达均与NF-κB信号通路有直接关系,而NF-κB信号通路的激活受ERK信号通路的调控。为深入探究NMB与NMBR调节H9N2亚型流感病毒感染诱导PD-L1上的作用,本研究以H9N2亚型流感病毒为模式毒株,基于NMBR干扰和过表达细胞系、PD-L1干扰和过表达细胞系以及C57BL/6小鼠,采用RT-PCR和Western blot方法分析NMB与NMBR对PD-L1表达变化以及ERK磷酸化的影响。结果显示:H9N2亚型流感病毒感染诱导的NMBR和PD-L1表达之间存在着负调控的关系,外源性NMB可以有效激活小鼠体内NMBR的表达,进而抑制PD-L1表达,NMB与NMBR也能影响H9N2感染诱导的ERK磷酸化水平。综上,H9N2亚型流感病毒感染诱导表达的NMB与NMBR通过ERK信号通路调节PD-L1的表达而发挥抗流感病毒作用,将为深度剖析宿主-甲型流感病毒之间的互作关系提供新的科学依据。

H9N2亚型流感病毒感染过程中神经介素B及受体对NF-κB信号通路泛素酶的调控

神经介素B(neuromedin B,NMB)及受体(NMB receptor,NMBR)通过NF-κB信号通路参与抑制甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)H1N1亚型(IAV/H1N1)的感染。但关于NMB和NMBR对NF-κB信号通路相关泛素蛋白酶的调控如何,尚未见报道。为探究NMB和NMBR调控IAV诱导的NF-κB信号通路相关的泛素蛋白酶表达的影响,本研究基于IAV/H9N2感染sh-NMBR细胞与NMB刺激的A549细胞,采用RT-PCR、qRT-PCR及Western blot(WB)分析NMB和NMBR对H9N2感染引起的NF-κB信号通路相关的E3泛素连接酶Mind bomb-2(MIB2)和Ring Finger Protein 8(RNF8)及去泛素蛋白酶Cylindromatosis(CYLD)的表达变化。结果显示:H9N2感染sh-NMBR细胞中,RNF8和CYLD表达增加,MIB2表达和P65磷酸化水平降低;NMB激活A549细胞中NMBR的表达后,诱导细胞中RNF8和CYLD的表达水平下降,MIB2表达和P65磷酸化水平增加。结果表明:NMB和NMBR通过调控IAV/H9N2感染诱导的泛素蛋白酶的表达和P65活性,从而影响IAV/H9N2感染激活的NF-κB信号通路的功能,该结果为深入研究NMB和NMBR抑制甲型流感病毒感染的作用机制提供了理论基础。

甘草主要成分抗H9N2亚型流感病毒作用研究

利用H9N2亚型流感病毒鼠肺适应株感染小鼠,以肺指数抑制率、肺组织病毒滴度、死亡保护率和生命延长率为评价指标,研究了甘草酸单铵盐、甘草次酸、甘草黄酮等甘草中3种主要成分和甘草粗提物对感染H9N2亚型流感病毒小鼠的防治效果。结果表明,甘草粗提物及甘草酸单铵盐口服均能显著抑制H9N2亚型流感病毒鼠肺适应株引起的小鼠肺炎实变(P<0.01),甘草粗提物20 mg/kg组能明显延长流感病毒感染小鼠的生存时间。

我国部分鸡源H9N2亚型流感病毒NS1基因序列分析

对 1 996年至 2 0 0 1年间自我国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的 8株H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白基因 (NS1 )进行了扩增和序列测定 ,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性。结果表明 ,NS1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为 96 5 %～ 99 5 %和94 5～ 98 6% ,说明NS1基因在遗传进化上高度保守 ,稳定遗传。与中国香港、韩国、巴基斯坦及人源H9N2分离株相比较 ,发现中国大陆的鸡源H9N2分离株的NS1基因在其羧基端缺少 1 3个氨基酸。系统进化树分析表明 ,该 8株病毒的NS1基因属于相同的进化分支 ,而且中国的早年分离株A chicken Beijing 1 94位于该进化分支的根部 ,暗示这些分离株的NS1基因是由A chicken Beijing 1 94演化而来 ;尚未发现NS1基因属于A quail HongKong G1 97 like分支的分离株。同时 ,系统进化树也说明了我国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化分支 。

广西野鸟H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

【目的】探讨H9N2亚型流感病毒在野鸟中的存在与传播,为广西流感疫情动态监测和防控及人流感预防监测提供重要依据。【方法】采集广西野鸟肺脏组织,将病料接种于9~11日龄SPF鸡胚尿囊腔进行分离培养,血清学试验鉴定HA和NA亚型,并克隆扩增其HA和NA基因。【结果】该分离株能被H9亚型阳性血清抑制,神经氨酸酶抑制（NI）试验结果将其鉴定为N2亚型,判断该病毒属于H9N2亚型流感病毒,命名为A/wildbird/Guangxi/H2/07,对HA和NA基因进行序列分析,发现与流感病毒H9亚型和N2亚型同源性最高,分别达到82.4%~99.0%和83.1%~99.9%。【结论】H9N2亚型流感病毒已在广西野鸟中存在,该结论为广西流感疫情动态监测和防控提供了重要依据。

一株鹅源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定及其HA基因的遗传进化分析

2014年从山东省某鹅场发病鹅体内分离到一株具有血凝性的病毒,对其进行鉴定,并对其HA基因和NA基因进行克隆测序,分析了解其与其他H9N2各毒株间的变异关系和进化规律。结果表明：经HI交叉抑制试验和基因克隆最终证实该毒株为H9N2亚型流感病毒,将其命名为A/goose/Shandong/XJ/2014（H9N2）,简称XJ。XJ分离毒株的HA基因裂解位点序列为PSRSSRGLF,为弱毒毒株的特征序列。其HA基因与其他参考株HA基因的核苷酸序列同源性为87.2%~99.9%,氨基酸序列同源性为87.4%~99.8%。XJ与国内大部分同期分离毒株遗传距离较近,尤其是2013年以后的分离毒株。

中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定

猪是禽流感病毒"禽＿猪＿人"传播链中重要的中间宿主,了解猪流感的疫情动态将为动物流感及人流感的疾病预测及防制提供重要依据。1999～2001年间进行的血清学和病毒学监测发现我国猪群存在大范围的H1和H3亚型猪流感感染(李海燕等,2002)。2002～2003年,我们进一步对来自全国14个省市的1936份血清进行了H9亚型猪流感的检测,同时在广东、福建等省进行了H5亚型猪流感的检测。2002年辽宁、广东、山东及重庆猪血清中出现H9亚型流感抗体,阳性率分别为7.3%、6.8%、5.1%和1.6%。2003年采集的猪血清H9亚型流感抗体均为阴性,同时发现广东、福建两省2003年出现H5亚型流感阳性猪群,阳性率分别为4.7%和8.2%。从2001～2003年收集和送检的样品中分离鉴定了6株H9N2亚型和2株H5N1亚型猪流感病毒,部分序列分析发现H9和H5亚型猪流感病毒均与我国分离的禽流感病毒高度同源。本研究进一步确证了我国猪群中存在H9N2亚型流感病毒,并且首次发现我国猪群已出现H5N1亚型流感病毒,为人类流感及动物流感的防制敲响了警钟。对这两个亚型流感病毒所具有的公共卫生和兽医公共卫生危害性应予以高度重视。

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。

猪源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

2008年10月~2009年3月采集剖检病死猪喉拭样品41份,从中分离鉴定了2株H9N2亚型猪流感病毒,对其进行部分生物学特性的研究、全基因测序和遗传演化分析,发现血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白335~338的裂解位点上,A/Swine/Yangzhou/1/08为RSNR,A/Swine/Taizhou/5/08为RSSR,均为典型低致病性禽流感病毒的特征性序列。2株病毒的HA、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）、非结构蛋白（nonstructural protein,NS）、血清前白蛋白（prealbumin,PA）和多聚酶蛋白（polymerase protein1,PB1）基因均来源于A/Chicken/Shanghai/F/98,基质蛋白（matrix,M）基因与A/Swine/Yangzhou/1/08的PB2基因来源于A/Quai/Hong Kong/G1/97,值得注意的是A/Swine/Taizhou/5/08的PB2基因虽然可能来源于A/Chicken/Shanghai/F/98但与A/environment/Hunan/1-35/2007（H5N1）的高度同源,生物学特性试验也表明A/Swine/Taizhou/5/08比A/Swine/Yangzhou/1/08毒力强。

我国鸡源与人源H9N2亚型流感病毒聚合酶PB1基因的关系分析

目的 通过对 1996～ 2 0 0 1年自我国部分养鸡场分离鉴定的 8株H9N2亚型鸡流感病毒聚合酶PB1基因测序 ,了解鸡源与人源H9N2亚型流感病毒聚合酶PB1基因的关系。方法 病毒在鸡胚中传代 ,自收获的尿囊液提取RNA ,通过RT-PCR ,扩增聚合酶PB1基因片段 ,并进行序列测定 ,测序结果采用PHYLIP软件在Internet网上分析处理 ,并用TreeView软件绘制系统进化树。结果 8株H9N2亚型鸡流感病毒聚合酶PB1基因的核苷酸同源性为 97 4 %～ 99 7% ,与三株人源H9N2病毒A/Guangzhou/ 333/ 99、A/HongKong/ 10 73/ 99、A/HongKong/ 10 74 / 99的同源性分别为 90 6 %～ 91 9%、90 4 %～91 5 %、90 2 %～ 91 3%。该 8株鸡源H9N2病毒PB1基因属于相同的进化分支 ,即A/duck/HongKong/Y2 80 / 97-like分支 ,而与该 3株人源株H9N2病毒属于不同的进化分支 ;尚未发现PB1基因属于A/ quail/HongKong/G1/ 97或A/duck/Hong/Y4 39/ 97分支的鸡源分离株。结论 在我国养鸡业流行的H9N2病毒分离株与目前已分离的人源株H9N2病毒其PB1基因属于不同的进化亚分支 ,人源株H9N2病毒PB1基因不是来源于鸡源H9N2病毒。

用MDCK细胞分离出禽H9N2亚型流感病毒

对患儿咽拭子用MDCK细胞病毒分离、患儿及其母亲血清H1测定以确定广州市是否有禽流感 (H9N2 )感染 .咽拭子分离出禽流感H9N2及出现自身H9N2抗体 ,H1滴度 16 0 ,母亲H9N2抗体 1:2 0 .可确定广州市有H9N2感染 。

2株鹌鹑H9N2亚型流感病毒的分离鉴定

对2006-2014年河北省部分养殖场病死鹌鹑采集的气管拭子样品23份,通过病毒分离、血凝试验(HA)、血凝抑制(HI)试验及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定出2株H9N2流感病毒,分别命名为A/Quail/Hebei/LC02/2008(H9N2)(简称Qa/LC02/08)和A/Quail/Hebei/LC01/2011(H9N2)(简称Qa/LC01/11)。通过对HA和NA基因测序后在线BLAST同源性分析表明,Qa/LC02/08与Qa/LC01/11 HA和NA基因的核苷酸同源性分别为97.7%和93.6%;Qa/LC02/08 HA核苷酸与A/Chicken/Shandong/JN/1999(H9N2)及A/Chicken/Zhejiang/ZC28/2007(H9N2)同源性最高,均为99.39%;NA基因核苷酸与A/Chicken/Shandong/N/2010(H9N2)的同源性为99.12%;Qa/LC01/11 HA和NA基因核苷酸与A/Chicken/Hebei/FL/2011(H9N2)同源性分别为99.63%和99.7%。本试验为阐明河北省鹌鹑流感流行病学及制定防控措施提供了科学依据。

H9N2亚型流感病毒对商品代肉雏鸡免疫系统的影响

对H9N2亚型流感病毒感染商品代肉雏鸡免疫器官的病理组织学变化进行了系统研究。结果显示,感染H9N2后胸腺、法氏囊、脾等均表现不同程度的病理学损伤;人工感染H9N2亚型流感病毒后,用新城疫(ND)疫苗免疫,其ND的HI抗体滴度较对照组有所下降,说明H9N2可对雏鸡造成严重的免疫抑制。

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

【目的】了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础。【方法】运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05(H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析。【结果】扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717aa。经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%～100.0%和98.5%～99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近。【结论】广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题。

2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析

【目的】明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性(抗原性、耐药性和致病性),为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据。【方法】以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)为研究对象,运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段(HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因),经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析。【结果】2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框(ORF)分别是PB2:2280 bp、PB1:2274 bp、PA:2151 bp、HA:1683 bp、NP:1497 bp、NA:1410bp、M:982 bp和NS:838 bp。2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,在基因型分类上属于G57基因型,为我国广泛流行的H9N2亚型基因型。2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变,NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变,但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变,且M2氨基酸位点发生S31N突变。2株广西猪源H9N2亚型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点(NCS);NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点,也未出现NA蛋白颈部杆状结构63~65 aa缺失现象,在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234aa处非常保守,但发生W402S突变。【结论】从广西百色分离获得的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)虽为低致病力毒株,但在流感病毒基因重组过程中发挥重要作用,且其致病性有增强趋势,已对金刚烷胺类药物产生耐药性。因此,应加强广西地区哺乳动物H9N2亚型流感病毒的监控,并警惕其跨种间传播。

犬源H9N2亚型流感病毒的遗传进化及其致病性分析

【目的】明确犬源H9N2亚型流感病毒的分子变异特征及致病性,为今后探究流感病毒的禽—犬跨种传播机制提供科学依据。【方法】从流浪犬中分离H9N2亚型流感病毒,利用RT-PCR扩增其8个基因节段进行BLAST同源比对,然后基于国内外的22株参考毒株进行遗传进化分析,并通过小鼠滴鼻感染试验评估分离毒株的致病性。【结果】从采集的393份犬鼻拭子样品中分离获得1株H9N2亚型流感病毒,命名为A/canine/Guangxi/LZ11/2018(简写为LZ11)。分离毒株LZ11为三重组毒株,其中,HA、NA和NS基因属于BJ/94类谱系,PB2和M基因属于G1类谱系,PB1、PA和NP基因属于F/98类谱系;病毒基因组成属于近年我国广泛流行的S基因型。分离毒株LZ11的HA蛋白在第324~331位存在1个裂解位点(PSRSSR↓GL),符合低致病性流感病毒的特征;HA蛋白还出现226Q→L突变,具有优先结合人类α-2,6唾液酸受体的能力;NA蛋白在119E、151D、276E、292R和294N未发生突变,但M2蛋白出现31S→N突变,说明分离毒株LZ11仍对神经氨酸酶抑制剂敏感,但已对金刚烷胺类药物产生耐药性;聚合酶蛋白出现多个哺乳动物适应性相关的氨基酸位点突变,包括PB2蛋白的292I→V、PB1蛋白的368I→V及PA蛋白的409S→N和356K→R。分离毒株LZ11虽然未引起小鼠出现典型的临床症状,但可在肺脏和上鼻窦有效复制,病毒滴度分别为3.82和5.98 lg PFU/mL。【结论】分离获得的犬源H9N2亚型流感病毒属于近年流行的S基因型,其8个基因节段分属于3种谱系(BJ/94类谱系、G1类谱系和F/98类谱系),且存在多个哺乳动物适应性相关氨基酸位点突变,具备感染哺乳动物的分子特征,可在小鼠脏器内有效复制。鉴于人类与宠物犬的密切关系,今后应加强对犬源H9N2亚型流感病毒的监测与防控。

含有WSN病毒基因的重组H9N2亚型流感病毒的复制能力研究

禽流感病毒不仅严重危害养禽业,而且给公共卫生造成巨大威胁。禽流感病毒与哺乳动物流感病毒发生重组是造成数次流感大流行的重要前提。本研究利用H9N2亚型禽流感病毒(A2093株)和WSN的反向遗传操作系统,用A2093株的膜蛋白基因(HA基因和NA基因)与某个聚合酶或NP基因替换WSN的相应基因,获得了r2093HANAPB2/WSN、r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、r2093HANANP/WSN四种重组病毒,在MDCK、DF1、A549三种细胞系进行了病毒生长曲线的测定,并研究了这些病毒在小鼠体内的复制能力。结果显示,0.001 MOI的剂量感染不同细胞后,病毒滴度均在感染后24 h达到峰值;在3种细胞上r2093HANAPB1/WSN和r2093HANAPA/WSN均表现出较强的复制能力。在小鼠体内,4株重组病毒的复制能力均介于亲本毒A2093和WSN之间,在肺脏中4株重组病毒的复制能力相似,但在鼻腔中r2093HANAPB1/WSN和r2093HANAPA/WSN的复制能力明显高于r2093HANAPB2/WSN和r2093HANANP/WSN。研究结果表明,与禽流感病毒的不同聚合酶或NP基因重组产生的新病毒,其复制能力具有明显差别,造成这种差异的分子机制值得进一步研究。

广西犬源H9N2亚型流感病毒分离株的全基因组测序分析及其对小鼠的致病性实验

目的对广西犬只尤其是宠物犬中携带H9N2亚型流感病毒进行全基因组序列特征分析以及小鼠的致病性研究,为流感病毒疫情的防控提供科学依据。方法采用RT-PCR的方法扩增、测序全基因组,DNAStar和MEGA6.0软件分析氨基酸同源性和进化树,通过小鼠感染实验探究其致病性。结果13株H9N2毒株8个基因节段来源于5个不同谱系的毒株,属于新基因型,氨基酸同源性与广西分离株A/equine/Guangxi/3/2011≥99.0%,6个内部基因与2013年自人流感病毒分离株H7N9亲缘关系密切。毒株HA的裂解位点均为RSSR↓GLF,表明低致病力。氨基酸位点HA226、NA119、NP375和PB2的701位等有变化,其中HA226位为亮氨酸L,具有与人SAα2,6-Gal结合的特性。BALB/c小鼠感染健康犬只中分离的H9N2病毒未在体内复制,而源自感冒犬只的毒株Ca/GX/8和Ca/GX/10能够在体内复制,临床症状明显但不致死。病毒经小鼠体内传代后致病力增强,推测是PB2的611位和PA623位氨基酸改变导致。结论从广西各地犬只中获得的13株H9N2亚型流感病毒株经分析发现虽源于禽源,但具备和人源受体特异性结合的能力,且内部基因遗传进化关系复杂,对哺乳动物及人类存在较大威胁,亟需加强防控。